結(jié)核病生物診斷試劑豚鼠模型建立

龔寶勇，吳玉娥，黃姣艷，崔玉華，張 鈺

(1. 廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663；2. 廣東省實驗動物重點實驗室，廣州，510663；3. 廣東瀚森生物藥業(yè)有限公司，東莞 523808)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的人畜共患慢性傳染病，在世界范圍內(nèi)具有高致病性和致死性。有關(guān)結(jié)核病的各項研究已成為全球?qū)W者關(guān)注的熱點，特別是結(jié)核病生物診斷試劑的研究和開發(fā)[1]。結(jié)核病生物診斷試劑的上市和臨床應(yīng)用必須經(jīng)過動物模型評價，因此建立合適的結(jié)核病生物診斷試劑模型，可避免人體試驗的風(fēng)險，還可嚴(yán)格控制實驗條件，增強(qiáng)實驗材料可比性和重復(fù)性，有利于更全面認(rèn)識生物診斷試劑的有效性和安全性[2]。豚鼠對結(jié)核分枝桿菌高度敏感，遲發(fā)型超敏反應(yīng)非常強(qiáng)烈，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于抗結(jié)核藥物和相關(guān)生物制劑檢測中，成為人類結(jié)核菌素皮膚試驗效能和結(jié)核檢測生物制品鑒定效價的金標(biāo)準(zhǔn)[3-5]，而且根據(jù)《中國藥典》2010版第三部，必須應(yīng)用致敏豚鼠來評價體內(nèi)診斷類結(jié)核病生物診斷試劑[7]。本研究旨在探索不同滅活H37Rv全菌體致敏劑量和致敏次數(shù)及皮試次數(shù)對模型結(jié)果的影響，為建立更簡單、安全、可靠的結(jié)核病生物診斷試劑模型提供參考。

1 材料和方法

1.1 注射菌液制備

H37Rv菌株用Middlebrook 7H11培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d，收集菌體，PBS洗3次，115℃，10 l b滅活30 min，干燥，放于4℃冰箱備用。稱取滅活H37Rv全菌體，加入注射用生理鹽水和等量弗氏不完全佐劑，研磨均勻乳化至滴入清水不散開。共配成3個劑量組：0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗動物

SPF級Hartley豚鼠，雌雄各半，35～45日齡，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2008-0002。動物飼養(yǎng)于屏障動物實驗室，實驗動物使用許可證編號：SYXK(粵)2012-0122，飼養(yǎng)管理嚴(yán)格按照《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》進(jìn)行。

1.3 致敏和皮試

致敏劑量評估：豚鼠檢疫適應(yīng)7 d后，分為3組(0.2 mg/mL劑量組、0.3 mg/mL劑量組、0.5 mg/mL劑量組)，每組44只，雌雄各半，每只豚鼠大腿內(nèi)側(cè)腹股溝皮下注射相應(yīng)劑量滅活H37Rv全菌體0.5 mL，分3個位點進(jìn)行注射。致敏后第5周背部剃毛，皮內(nèi)注射0.1 mL(5IU)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌素(TB-PPD)進(jìn)行皮試。皮試后24 h、48 h各觀察豚鼠1次，測量、記錄皮試紅斑硬結(jié)的縱橫徑值，對各組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

致敏次數(shù)評估：選擇8只豚鼠，雌雄各半，接種0.5 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏，每次0.5 mL，每周1次，持續(xù)3周。首次致敏后第5周背部剃毛，皮內(nèi)注射0.1 mL(5 IU)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌素(TB-PPD)進(jìn)行皮試。皮試后24 h、48 h各觀察豚鼠1次，測量、記錄皮試紅斑縱橫徑值并計算統(tǒng)計其均值，與致敏劑量為0.5 mg/mL致敏1次的豚鼠進(jìn)行比較。

皮試時間評估：選擇8只豚鼠，雌雄各半，0.3 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏，致敏后第5、7、9、11周背部剃毛，皮內(nèi)注射0.1 mL(5IU)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌素(TB-PPD)重復(fù)進(jìn)行皮試。比較不同皮試時間紅斑的縱橫徑值。

1.4 觀察指標(biāo)

致敏后每周1次稱量豚鼠體重，連續(xù)5周，制作體重生長曲線；致敏后每周觀察豚鼠腹股溝皮下注射部位潰爛情況，連續(xù)5周。皮試后24 h、48 h各觀察豚鼠1次，測量、記錄皮試紅斑的縱橫徑值并計算統(tǒng)計其均值。

1.5 判定依據(jù)

根據(jù)《中國藥典》2010版第三部，致敏豚鼠應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核菌素(TB-PPD)皮試后24 h紅斑縱橫徑值應(yīng)大于5 mm，才能用于評價體內(nèi)診斷類結(jié)核病生物診斷試劑[7]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 致敏豚鼠體重變化情況

不同劑量滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠后，動物飲食、飲水正常，體重持續(xù)增加。在致敏后第5周，0.2 mg/mL劑量組、0.3 mg/mL劑量組和0.5 mg/mL劑量組平均體重分別為：(478.7±38.5)g、(493.0±53.0)g和(490.6±43.5)g，與初始平均體重比較，體重分別增加了158.6 g、142.1 g和195.7 g。結(jié)果見圖1。

圖1 不同劑量滅活H37Rv全菌體致敏后豚鼠體重曲線

2.2 不同劑量致敏豚鼠后注射部位變化

豚鼠注射0.5 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏后，注射部位出現(xiàn)硬節(jié)和潰爛。潰爛出現(xiàn)的時間在致敏后第4周，有18.9%的豚鼠發(fā)生潰爛，第5周有33.3%的豚鼠發(fā)生潰爛，在整個實驗周期內(nèi)潰爛不會愈合。見圖2。

2.3 不同劑量滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠后紅斑縱橫徑值比較

皮試后24 h，0.3 mg/mL組和0.5 mg/mL組皮膚紅斑縱橫徑平均值均小于0.2 mg/mL組(15.4±2.3)mm，三組比較，差異有顯著性(P≤0.05)。皮試后48 h，3個劑量組皮膚紅斑縱橫徑值比較，差異無顯著性(P≥0.05)。結(jié)果見表1。

2.4 多次致敏和單次致敏皮膚紅斑縱橫徑值比較

實驗結(jié)果顯示，采用0.5 mg/mL 致敏劑量連續(xù)三次致敏豚鼠，皮試后24 h和48 h紅斑縱橫徑均值與單次致敏豚鼠的紅斑縱橫徑均值相比較無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

2.5 不同皮試次數(shù)紅斑縱橫徑值比較

實驗結(jié)果顯示，采用0.3 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠，第1次皮試后24 h紅斑縱橫徑值大于第2次、第3次和第4次皮試后紅斑縱橫徑值，各組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.05)；皮試后48h測量發(fā)現(xiàn)第2次皮試后紅斑縱橫徑值顯著低于其它3次皮試后紅斑縱橫徑值( (P≤0.05)，結(jié)果見表3。

表1 滅活H37Rv全菌體不同致敏劑量皮試紅斑縱橫徑值比較

表2 0.5 mg/mL滅活H37Rv全菌體3次致敏與單次致敏豚鼠皮試紅斑縱橫徑值比較

表3 0.3 mg/mL滅活H37Rv全菌體致敏后不同皮試次數(shù)后紅斑縱橫徑值的變化

3 討論

自從結(jié)核菌素反應(yīng)被羅伯特·科克在一個世紀(jì)前發(fā)現(xiàn)以來，豚鼠就成為研究遲發(fā)型致敏反應(yīng)(DTH)的動物模型，且其DTH反應(yīng)與人類進(jìn)行的TB-PPD皮試反應(yīng)非常相似[6]。根據(jù)《中國藥典》2010版第三部，必須應(yīng)用豚鼠來評價體內(nèi)診斷類結(jié)核病生物診斷試劑[7]。

我們的研究結(jié)果顯示，采用0.2 mg/mL H37Rv滅活全菌體單次致敏豚鼠，24 h和48 h皮試紅斑縱橫徑均值分別為15.4±2.3 mm和11.0±2.2 mm，達(dá)到《中國藥典》2010版第三部規(guī)定的“致敏豚鼠皮試后24 h紅斑縱橫徑值應(yīng)大于5 mm”的判定要求。張靈霞等[11]采用0.1 mL (5 mg)滅活H37Rv全菌體連續(xù)4次致敏豚鼠，皮試后24 h和48 h紅斑縱橫徑均值分別為(8.25±1.73)mm和(7.41±1.22)mm，小于我們的致敏結(jié)果。我們分析此模型皮試反應(yīng)強(qiáng)度較弱可能與其未使用弗氏不完全佐劑有關(guān)。Suely S. Kashino等[8]應(yīng)用18b結(jié)核分支桿菌活菌制備豚鼠模型比應(yīng)用滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠模型DTH反應(yīng)更強(qiáng)烈，24 h DTH皮試反應(yīng)紅斑縱橫徑值為(18±3)mm，但會引起動物消瘦甚至死亡。根據(jù)我們的研究結(jié)果和已知文獻(xiàn)[8,11]，我們發(fā)現(xiàn)豚鼠DTH皮試反應(yīng)的強(qiáng)度與結(jié)核分支桿菌是否滅活有關(guān)，與致敏次數(shù)無關(guān)，多次致敏不能達(dá)到增加變態(tài)反應(yīng)強(qiáng)度的效果。當(dāng)致敏劑量達(dá)到可引起明顯DTH皮試反應(yīng)的情況下，增加致敏劑量對皮試結(jié)果無顯著影響，反而可能會引起接種部位的嚴(yán)重潰爛。

人類感染結(jié)核桿菌后，會引起嗜睡、精神萎靡、體重減輕直至死亡等[9]，本研究應(yīng)用滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠，豚鼠體重持續(xù)增長，未觀察到豚鼠有明顯不適反應(yīng)。注射部分出現(xiàn)潰爛主要是弗氏不完全佐劑引起的不良反應(yīng)[10]，采用多點注射可以適當(dāng)降低潰爛的發(fā)生率。

總之，本研究完善了結(jié)核病生物診斷試劑模型建立，改進(jìn)了制備滅活H37Rv全菌體致敏豚鼠模型的方法。與國內(nèi)外文獻(xiàn)記載的其他結(jié)核病生物診斷模型制備方法相比，本研究采用0.2 mg/mL H37Rv滅活全菌體單次致敏豚鼠，可引起適當(dāng)?shù)淖儜B(tài)反應(yīng)(達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求)且不會引起動物死亡，是比較合適的致敏劑量，可廣泛應(yīng)用于結(jié)核病生物診斷試劑的研制和評價。

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