雪貂感染H7N9禽流感病毒動物模型的建立

鄧 巍，許黎黎，鮑琳琳，朱 華，陳 霆，呂 琦，李楓棣，袁 靜，向志光，高 凱，徐艷峰，黃 瀾，李彥紅，劉江寧，姚艷豐，于 品，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

2013年3月在中國東部地區(qū)爆發(fā)了H7N9禽流感疫情，患者的主要表現(xiàn)為進(jìn)行性重度肺炎和呼吸困難[1]。截止至8月6日，全國10省市發(fā)生人感染H7N9禽流感病例132例，其中死亡43人。因此在疫情不斷發(fā)展的情況下，迅速建立該疾病的實(shí)驗(yàn)動物模型，為H7N9禽流感發(fā)病機(jī)制研究、疫苗及藥物的評價提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)是必要而迫切的。自1933年以來雪貂因其對人和禽流感病毒易感，就一直被用作流感模式動物[2]。 感染流感病毒后，雪貂的呼吸道癥狀以及肺部病變與人類十分相似[3]。本實(shí)驗(yàn)利用雪貂(Mustela putorius furo) 成功建立了H7N9感染的實(shí)驗(yàn)動物疾病模型。

1 材料與方法

1.1 病毒

流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9) 來自于第3例確診的H7N9患者，接種9～11 d SPF 雞胚，然后在MDCK細(xì)胞上傳代一次。

1.2 細(xì)胞

MDCK細(xì)胞購自ATCC，無支原體污染，細(xì)胞用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(MEM, Invitrogen)，培養(yǎng)基內(nèi)加入10%的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素，培養(yǎng)條件為 37℃，5% CO2。

1.3 動物感染及標(biāo)本采集

9只SPF級雪貂購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，6～12月齡，所有動物血清對流行的流感病毒的血凝抑制(HI)試驗(yàn)檢測結(jié)果均為陰性。雪貂分2組，第一組3只，每只動物滴鼻感染400 μL 108TCID50的A/Anhui/1/2013 (H7N9)病毒，每天進(jìn)行CT肺部掃描查；第二組6只動物，每只動物滴鼻感染400 μL 106TCID50的A/Anhui/1/2013 (H7N9)病毒，在感染后的第3、第7天分別隨機(jī)安樂死1只動物，對其氣管、肺、腦、心臟、肝臟、脾、腎、胃、十二指腸以及嗅球進(jìn)行病理及病毒學(xué)檢測。所有9只雪貂每天記錄臨床癥狀及體重，分別在感染后第1，3，5，7，9天采集感染雪貂的鼻拭子和咽拭子，保存于1 mL PBS中，并接種于MDCK細(xì)胞，測定病毒滴度。

本實(shí)驗(yàn)由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所動物使用和倫理委員會批準(zhǔn)(ILAS-PC-2013-009)。所有的實(shí)驗(yàn)都按照WHO指導(dǎo)原則在ABSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行(許可證號：ABSL3-021，CANS BL0010)。

1.4 病毒滴度

本實(shí)驗(yàn)采用MDCK細(xì)胞測定病毒的滴度。10倍系列稀釋的各組織勻漿、鼻拭子、咽拭子接種于單層MDCK細(xì)胞中，37℃ 孵育1 h后，用PBS洗一次，并加入200 μL病毒培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基中加入100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素和1 μg/mL 胰蛋白酶)，接種后第3天，收集被感染細(xì)胞上清，用火雞血測定凝血活性，以此判定細(xì)胞是否被感染。利用Reed-Muench 計(jì)算組織細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)[4]。

1.5 組織病理和免疫組化

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行動物尸檢，組織置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(H&E)染色，光學(xué)顯微鏡檢查。免疫組化使用抗甲型流感病毒核蛋白的單克隆抗體(1∶200稀釋, IRR 公司, 貨號: FR-51) 4℃過夜，PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋，Sigma公司，貨號：PV-9002)，加入3-3-二氨基聯(lián)苯胺 (DAB)，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 血細(xì)胞分析

采集每只動物外周血保存于肝素抗凝管內(nèi)，利用ACT TM(貝克曼公司，美國)血常規(guī)儀對血樣本進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。

1.7 Micro-CT掃描

使用Micro-CT掃描儀(西門子醫(yī)療公司，德國)觀察雪貂肺部情況，感染雪貂麻醉后平躺在CT床上，保持呼吸通暢。管電壓為70 kV，電流為400 mA，曝光時間為800 ms，掃描范圍(FOV)為72.44 mm×71.31mm。通過單球管/探測器CT系統(tǒng)以步進(jìn)1度旋轉(zhuǎn)360度以獲得圖像投影。使用市售的濾波反投影技術(shù)成像軟件(COBRA Exxim, v6.3) 進(jìn)行圖像重建。

1.8 血凝抑制試驗(yàn)(HI)

使用0.5%的火雞血進(jìn)行雪貂血清的血凝抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。采集雪貂外周血，分離血清，按照WHO頒布的標(biāo)準(zhǔn)HI測定方法測定收集的血清對H7N9病毒的血凝抑制價[5]。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

雪貂的體重、病毒拷貝數(shù)以及病毒滴度在不同組之間存在的差異進(jìn)行ANOVA單因素方差分析和Bonferroni校正分析。兩組之間的差異運(yùn)用SPSS 11.5 軟件包中的t-test進(jìn)行分析。P<0.05時，兩者之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 癥狀和體征

兩個感染劑量組的雪貂均表現(xiàn)出發(fā)熱，體重下降，打噴嚏，流鼻涕，嗜睡(封底圖1A和1B，表1)，食欲下降。在感染后14 d的觀察期內(nèi)，108劑量組的雪貂體溫最高可達(dá)到40.0℃(感染后第2天)體重降低程度最高可達(dá)10.7%(感染后第7天)，106劑量組的雪貂則分別為40.1℃(感染后第4天)和9.3%(感染后第5天)(圖2A和2B)。

此外，108劑量組的3只雪貂CT掃描結(jié)果顯示，感染后第6～14天，在肺的左上葉、右上葉以及右中葉可見片狀炎癥陰影(封底圖1C)。

2.2 血液學(xué)變化

臨床報道感染H7N9病毒的患者白細(xì)胞數(shù)量下降[1,6-7]。在感染后第7天雪貂外周血檢測發(fā)現(xiàn)雪貂淋巴細(xì)胞明顯減少，而中性粒細(xì)胞增加明顯(P<0.05) (表2)。

2.3 動物排毒情況

感染后第1，3，5，7，9天采集感染雪貂的鼻拭子和咽拭子，接種MDCK細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度的測定。感染后第1天兩個劑量感染雪貂均開始排毒，一直持續(xù)到感染后第7天。兩個劑量上呼吸道排毒的峰值分別出現(xiàn)在感染后第3天的咽拭子(108劑量組)，滴度到達(dá)104.38TCID50/mL，以及感染后第5天的鼻拭子(106劑量組)，滴度為104.11TCID50/mL(圖2C)。

2.4 解剖及病理學(xué)變化

感染后第3和第7天隨機(jī)安樂死一只感染106TCID50H7N9禽流感病毒的雪貂，對其氣管、肺、腦、心臟、肝臟、脾、腎、胃、十二指腸以及嗅球進(jìn)行病理及病毒學(xué)檢測。組織病理學(xué)分析顯示雪貂肺組織于感染后第3天出現(xiàn)多病灶的輕度間質(zhì)性肺炎，感染后第7天肺組織可見局灶性間質(zhì)性肺炎及肺泡炎樣改變，病灶出現(xiàn)增大、熔合的現(xiàn)象(封底圖3C和3D)。另外，免疫組化結(jié)果顯示H7N9禽流感病毒可同時感染雪貂支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞 (封底圖3A和3B)。

注：圖A、B、C分別為雪貂感染后平均體溫、平均體重、及上呼吸道排毒平均水平。

表1 雪貂感染H7N9禽流感病毒后的臨床癥狀以及各組織病毒復(fù)制情況

表2 雪貂感染H7N9禽流感病毒后的血像變化情況

2.5 病毒在體內(nèi)分布情況

將感染后第3、7天的雪貂各組織勻漿，接種MDCK細(xì)胞，測定病毒滴度。結(jié)果顯示在感染后第3天肺、氣管、心臟、嗅球可檢測到活病毒，而在感染后第7天肺、氣管、肝臟可檢測到活病毒(表1)。H7N9禽流感病毒可在神經(jīng)系統(tǒng)(嗅球)復(fù)制的特性與高致病性禽流感H5N1，H7N7相似[8-10]。

3 討論

綜上，H7N9禽流感病毒可感染雪貂，引起動物出現(xiàn)典型的打噴嚏、發(fā)熱等臨床癥狀和體征，可檢測到上呼吸道排毒及肺、氣管、嗅球等組織內(nèi)的病毒復(fù)制情況，組織病理學(xué)變化可見肺組織炎性改變。雪貂感染H7N9禽流感病毒后的變化與人感染后的變化是相似程度較高[11-13]，說明雪貂可作為H7N9感染模型動物之一。雪貂感染H7N9模型動物的建立可為H7N9致病機(jī)制研究、治療藥物和疫苗的評價提供科學(xué)的動物模型基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus [J]. N Engl J Med. 2013, 368(20):1888-1897.

[2] Smith W, Andrewes CH, Laidlaw PP. A virus obtained from influenza patients [J]. Lancet 1933, 222:66.

[3] Maher JA, DeStefano J. The ferret: an animal model to study influenza virus [J]. Lab Anim (NY) 2004, 33(9):50-53.

[4] Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints [J]. The American Journal of Hygiene 1938, 27(3):493-497.

[5] World Health Organization Gisn. Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza [M]. Geneva, Switzerland: World Health Organization. 2011:140.

[6] Chang SY, Lin PH, Tsai JC, et al. The first case of H7N9 influenza in Taiwan [J]. Lancet 2013, 381(9878):1621.

[7] Chen Y, Liang W, Yang S, et al. Human infections with the emerging avian influenza A H7N9 virus from wet market poultry: clinical analysis and characterisation of viral genome [J]. Lancet 2013, 381(9881):1916-1925.

[8] Blisard KS, Davis LE. The sequence of changes in liver and brain in the influenza B virus mouse model of Reye’s syndrome [J]. J Neuropathol Exp Neurol. 1990, 49(5):498-508.

[9] Hodgson NR, Bohnet SG, Majde JA, et al. Influenza virus pathophysiology and brain invasion in mice with functional and dysfunctional Mx1 genes [J]. Brain Behav Immun. 2011, 26(1):83-89.

[10] Shinya K, Suto A, Kawakami M, et al. Neurovirulence of H7N7 influenza A virus: brain stem encephalitis accompanied with aspiration pneumonia in mice [J]. Arch Virol. 2005, 150(8):1653-1660.

[11] Belser JA, Gustin KM, Pearce MB, et al. Pathogenesis and transmission of avian influenza A (H7N9) virus in ferrets and mice [J]. Nature. 2013, 501(7468): 556-559.

[12] Watanabe T, Kiso M, Fukuyama S, et al. Characterization of H7N9 influenza A viruses isolated from humans [J]. Nature. 2013, 501(7468): 551-555.

[13] Zhu H, Wang D, Kelvin DJ, et al. Infectivity, transmission, and pathology of human H7N9 influenza in ferrets and pigs. Science 2013, 341(6142):183-186.