H1N1流感與H7N9禽流感感染BALB/c小鼠發(fā)病特點(diǎn)初步研究

楊玉琴，徐春華，朱召芹，田 棣, 陳麗香，楊 華, 秦波音，宋志剛，管文彩，劉 祎，蔡家麟，周曉輝，周文江,2

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508； 2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院， 上海 201203)

正粘病毒科禽流感血細(xì)胞凝集素神經(jīng)氨酸酶流感人類(lèi)禽流感H7N9亞型禽流感病毒是一種最近出現(xiàn)的新型H7N9禽流感病毒，其跨宿主在人類(lèi)進(jìn)行傳播，既往僅在禽間發(fā)現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)過(guò)人的感染情況[1-2]。H7N9新型流感病毒是由三個(gè)已知禽流感病毒部分重組獲得[3]。截至2013年5月31日，中國(guó)內(nèi)地共報(bào)告131例確診病例，其中康復(fù)78人，在院治療14人，死亡39人[4]。雖目前病例仍處于散發(fā)狀態(tài)，但目前仍無(wú)法排除其再次爆發(fā)的可能。最近研究結(jié)果顯示H7N9禽流感病毒具備“有限的人際傳播能力”，因此逐漸適應(yīng)中的H7N9禽流感病毒極有可能在未來(lái)發(fā)生大流行[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中發(fā)現(xiàn)，從患者分離的H7N9流感病毒可以成功感染小鼠甚至導(dǎo)致小鼠死亡，但由于H7N9流感病毒必須在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，嚴(yán)重影響了對(duì)它的致病機(jī)制的揭示。同時(shí)，在對(duì)H7N9的了解相對(duì)較少的情況下，需要借助目前在致病機(jī)制和治療研究較為深入的普通流感來(lái)對(duì)H7N9進(jìn)行比較探討。因此對(duì)于禽流感H7N9和普通流感發(fā)病特點(diǎn)的比較研究極為迫切，這將為禽流感H7N9的發(fā)病機(jī)制、藥物和疫苗的研究提供線索。

1 材料和方法

1.1 病毒

選擇H1N1病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(以下簡(jiǎn)稱H1N1 PR8)和H7N9病毒株 A/Shanghai/4664T(H7N9)(以下簡(jiǎn)稱H7N9)為研究對(duì)象，H7N9和 H1N1 PR8為本實(shí)驗(yàn)室保存。A/Shanghai/4664T為H7N9患者分離株。病毒經(jīng)MDCK細(xì)胞和雞胚培養(yǎng)滴定后，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)均在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(ABSL-3)中進(jìn)行[高致病性病原微生物實(shí)驗(yàn)室資格證書(shū)編號(hào)為衛(wèi)BSL3-007;中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可證書(shū)編號(hào)為NO.CNAS BL0016]，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)本單位動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均選用SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，6～8周齡 (體重18～20 g)。購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2008-0016]。

1.3 感染方案

將BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，即H1N1 PR8感染組、H7N9感染組和PBS對(duì)照組，每組10只，每籠5只，標(biāo)記后分別稱重。小鼠經(jīng)七氟烷輕度麻醉后，滴鼻感染小鼠，每只小鼠感染病毒或PBS的量為50 μL，病毒劑量為5×103TCID50/只，置獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(IVC)中正常飼養(yǎng)，逐日觀察小鼠發(fā)病情況，記錄體重及大體變化。

1.4 動(dòng)物取材

每日觀察感染小鼠的活動(dòng)狀態(tài)及臨床表現(xiàn)，稱量體重，每組感染小鼠分別于感染后第3天和第7天脫臼處死，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只，剩余小鼠繼續(xù)觀察體重及死亡情況。處死后小鼠取其肺臟，取左上肺葉于組織裂解液中用于提取組織RNA；左肺下葉于4%多聚甲醛溶液中固定，剩余肺葉于凍存管置-80%冰箱中備份保存。

1.5 肺組織總RNA提取及PCR檢測(cè)

使用Total RNA抽提試劑盒 (QIAGEN，美國(guó))抽提組織中的總RNA，抽提產(chǎn)物用微量分光光度計(jì)(Nanodrop 1 000, 美國(guó))測(cè)定核酸濃度(OD260/OD280)后，加 RNAase-free DNAse I 37℃ 放置20 min，然后 65℃ 放置10 min。純化后的樣本用One-step RT-PCR kit(TaKaRa，大連寶生物)進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增體系為25 μL：12.5 μL TaqMan PCR基礎(chǔ)液，400 nmol/L引物和300 nmol/L TaqMan探針，2.5 μL RNA模板。將96孔板子放入熒光定量PCR儀(Eppendorf Master cycler eprealplex,德國(guó))。擴(kuò)增程序: 42℃ 10 min；95℃1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)。

表1 H1N1 PR8 和H7N9引物序列

1.6 肺組織病理檢測(cè)

取小鼠肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

小鼠的體重變化(weightinfected day-weight0 day/weight0 day×100%)，肺指數(shù)(weight of lung ×100/bodyweight)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism Software 5.0對(duì)組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠感染后癥狀及大體觀察

正常PBS組小鼠皮毛光澤，反應(yīng)靈敏，飲食飲水正常，活動(dòng)正常，體重增長(zhǎng)。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠于感染后第2天體重開(kāi)始下降，感染后第3天開(kāi)始出現(xiàn)豎毛、聚集成堆、反應(yīng)遲鈍、呼吸急促、食欲減退以及活動(dòng)度下降嚴(yán)重。H1N1 PR8感染組小鼠在感染后第5天開(kāi)始死亡，對(duì)照組小鼠未見(jiàn)異常。在感染后7 d內(nèi)PBS組小鼠體重逐漸升高，H1N1 PR8組和H7N9組逐漸減低，H1N1 PR8組較H7N9組降低更為明顯，H1N1 PR8感染組在第7天降到30%以上，H7N9感染組降到20%以上(圖1)；H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠在感染后第7天肺指數(shù)較第3天高，PBS對(duì)照組無(wú)顯著變化。感染后3 d H1N1 PR8組小鼠肺指數(shù)與H7N9組和PBS組相比顯著增高(P<0.05)，感染后7 d H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠肺指數(shù)較PBS對(duì)照組相比顯著增高(P<0.05)(圖2)。

2.2 感染小鼠肺組織病毒載量測(cè)定

感染后的各組小鼠，于感染第3天和第7天處死，取肺組織勻漿上清進(jìn)行病毒載量分析。結(jié)果顯示PBS組檢測(cè)陰性，未檢出病毒。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組檢測(cè)均為陽(yáng)性，其病毒載量在感染后第3天均為最高，第7天均降低，H1N1 PR8感染組降低顯著(P<0.05)，H7N9感染組降低不明顯(P>0.05)。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組小鼠病毒載量在感染后第3天無(wú)顯著差異，第7天H7N9感染組顯著高于H1N1 PR8感染組 (P<0.05)。

注： *P<0.05，**P<0.01。

2.3 感染小鼠病理組織學(xué)觀察

2.3.1 肉眼觀察

正常對(duì)照組小鼠肺臟呈淡粉紅色，質(zhì)地柔軟，肺葉表面光滑潤(rùn)澤，無(wú)充血區(qū)。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組均出現(xiàn)不同程度的肺臟病理改變，充血現(xiàn)象明顯，呈現(xiàn)暗褐色外觀，肺重增加。感染后3 d H1N1 PR8感染組小鼠肺臟病變面積達(dá)10%，H7N9感染組小鼠未見(jiàn)顯著病變，感染后7 d H1N1感染 PR8感染組小鼠病變面積達(dá)95%以上，H7N9感染組小鼠病變面積只有80%左右。

2.3.2 鏡下觀察

正常對(duì)照組病理學(xué)檢查，肺間質(zhì)未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡大小正常，無(wú)擴(kuò)張及萎縮，肺泡間隔不增寬，各級(jí)支氣管上皮完整無(wú)滲出物，毛細(xì)血管無(wú)充血、出血現(xiàn)象，僅在小支氣管周?chē)猩倭苛馨图?xì)胞(彩插10圖4A,D)。H1N1 PR8感染組和H7N9感染組均出現(xiàn)了一定程度的病理改變，在感染后3 d H1N1 PR8感染組主要改變輕度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫(彩插10圖4B)；H7N9感染組主要是輕度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(彩插10圖4C)。在感染后7 d H1N1 PR8感染組主要改變是肺組織肺泡間隔增寬，肺內(nèi)小血管及肺泡間隔的毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，肺泡腔不同程度縮小，出現(xiàn)大面積肺水腫(彩插10圖4E)；H7N9感染組主要是大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，肺泡腔不同程度縮小，小部分區(qū)域出現(xiàn)實(shí)變(彩插10圖4F)。

3 討論

BALB/c小鼠是流感病毒研究中使用最為廣泛的哺乳動(dòng)物模型之一[7-8]，采用H1N1 PR8感染BALB/c小鼠建立流感動(dòng)物模型有很多報(bào)道[9-10]，近期有H7N9成功感染BALB/c小鼠的報(bào)道[11]。本研究主要是研究在同一感染劑量下，H1N1 PR8和H7N9病毒感染后小鼠的發(fā)病特點(diǎn)是否存在差異。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)H1N1 PR8和H7N9感染后小鼠在大體病變、病毒復(fù)制水平和病理病變等方面均存在一定程度的差異。從大體觀察表現(xiàn)來(lái)看，H1N1 PR8感染小鼠和H7N9感染小鼠在感染的7 d內(nèi)體重均降低，但H1N1 PR8感染小鼠更明顯；H1N1 PR8感染小鼠的肺指數(shù)在感染后第3天的肺指數(shù)就已經(jīng)增高，H7N9感染小鼠的肺指數(shù)在感染后第7天才增高。且H1N1 PR8感染小鼠在感染后第5天出現(xiàn)死亡，而H7N9感染小鼠未出現(xiàn)。病理結(jié)果也顯示在感染后第3天時(shí)H7N9感染小鼠病變較輕，總體來(lái)看H1N1 PR8感染小鼠比H7N9感染小鼠病變重。這可能最主要的原因?yàn)镠1N1 PR8為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的鼠適應(yīng)株，小鼠對(duì)其反應(yīng)比較敏感，在同等劑量下病變明顯；H7N9病毒為臨床分離株，對(duì)小鼠可以致病，但鼠適應(yīng)性較差。

從病毒復(fù)制水平來(lái)看， H1N1 PR8感染小鼠病毒載量在感染后第3天達(dá)最高后，第7天顯著降低，而H7N9感染小鼠在感染后第3天達(dá)最高后，第7天沒(méi)有顯著降低。這可能是小鼠對(duì)H7N9病毒的清除能力較弱。病理結(jié)果提示H1N1 PR8感染小鼠和H7N9感染小鼠在感染的7 d病變均較為嚴(yán)重，但H7N9感染小鼠病變主要是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而H1N1 PR8感染小鼠除炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)外，還有大面積的水腫。這可能是由于不同毒株觸發(fā)的小鼠免疫機(jī)制存在不同而造成的。

綜上所述，本次研究通過(guò)選用H1N1 PR8和H7N9感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠在兩種不同毒株感染下均可發(fā)病，但發(fā)病特點(diǎn)有所差異，由于H7N9未經(jīng)過(guò)鼠適應(yīng)性，因此對(duì)小鼠的致病性不是很高，但在小鼠體內(nèi)的復(fù)制力很強(qiáng)，可以保持一段很長(zhǎng)的時(shí)間，而H1N1 PR8則是致病性很強(qiáng)，但病毒迅速降低。這兩種病毒不同的致病特點(diǎn)將為H7N9致病機(jī)制與防治的研究提供初步線索，但是相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果提示，由于H7N9病毒對(duì)鼠的適應(yīng)性比H1N1 PR8差，后續(xù)用BALB/c小鼠進(jìn)行藥效和疫苗評(píng)價(jià)研究時(shí)需要考慮提高病毒滴度。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cowling BJ, Jin L, Lau EH,etal. Comparative epidemiology of human infections with avian influenza A H7N9 and H5N1 viruses in China: a population-based study of laboratory-confirmed cases [J]. The Lancet,2013, 382(9887):129-137.

[2] Xiang N, Havers F, Chen T,etal. Use of National Pneumonia Surveillance to Describe Influenza A (H7N9) Virus Epidemiology, China, 2004-2013[J]. Emerg Infect Dis, 2013, 19(11). doi: 10.3201/eid1911.130865.CrossRef.

[3] Gao R, Cao B, Hu Y,etal. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus[J]. N Engl J Med, 2013, 368(20): 1888-1897.

[4] http://www.chinacdc.cn/jkzt/crb/rgrgzbxqlg_5295/rgrqlgyp/201305/t20130503_80728.htm.

[5] Liu D, Shi W, Shi Y,etal. Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection: phylogenetic, structural, and coalescent analyses [J]. Lancet, 2013,381(9881):1926-1932.

[6] Ai J, Huang Y, Xu K,etal.Case-control study of risk factors for human infection with influenza A(H7N9) virus in Jiangsu Province[J]. Euro Surveill,2013,18(26): 20510 CrossRef.

[7] 劉穎，鄧巍，徐艷峰, 等. 甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比較[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志,2011,21(12):1-5.

[8] 彭春香. 小鼠模型在不同亞型流感病毒致病性及跨種傳播研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī),2012,39(12):154-158.

[9] 張炬榕,王濤,申元英,等. 甲型流感病毒感染BALB/c鼠動(dòng)物模型的建立[J]. 大理學(xué)院學(xué)報(bào), 2007,6(10):25-27.

[10] 鮑琳琳, 孫惠惠, 占玲俊, 等. 甲型H1 N1流感病毒感染小鼠的發(fā)病機(jī)制[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011,21(2):20-22.

[11] Zhaoqin Zhu, Yuqin Yang, Yanling Feng,etal. Infection of inbred BALB/c and C57BL/6 and outbred Institute of Cancer Research mice with the emerging H7N9 avian influenza virus [J]. Emerging Microbes & Infections, 2013,2:1-7.