五加皮體外抗甲型流感病毒的作用

周艷萌，陳博文，徐美霞，郎春媚

(1.遵義醫(yī)學院 微生物學與免疫學實驗室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與科技學院2010級，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學院 醫(yī)學與科技學院2008級，貴州 遵義 563099)

流行性感冒 (influenza,簡稱流感)是由流行性感冒病毒(influenza virus,簡稱流感病毒)引起的一種傳染病,無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家,每年的發(fā)病率都很高。在各型流感病毒中，宿主范圍最廣、對人類健康影響最大的是甲型流感病毒[1]。苗藥五加皮,具有清熱解毒,祛風除濕之功能[2]。本實驗采用流感病毒H1N1感染狗腎細胞(MDCK)，采用先感染病毒后給藥(治療給藥方式)、先給藥后感染病毒(預(yù)防給藥方式)、藥物與病毒同時作用(直接滅活方式)的3種給藥方式,觀察五加皮對病毒的作用并計算藥物的抗病毒有效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與藥物水浸液 五加皮購自貴州遵義市萬勝堂藥房。五加皮水浸液(0.1g/mL,每mL相當于生藥0.5g)。其方法是稱取五加皮粉末20g，加三蒸水200 mL浸泡15 d，濾紙過濾除去不溶物質(zhì)，用無菌濾器除菌密封后，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 病毒 甲型流感病毒H1N1，由遵義醫(yī)學院微生物教研室提供。

1.1.3 雞胚 9～11日齡雞胚，由遵義醫(yī)學院微生物教研室提供。

1.1.4 細胞株 MDCK，由遵義醫(yī)學院微生物教研室提供。

1.1.5 試劑及試劑制備 胎牛血清購自上海藍季科技發(fā)展有限公司，PBS、HEPES、DMEM為Solarbio公司，胰蛋白酶購于華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 H1N1流感病毒傳代增殖 選擇9～10日齡健康雞胚,將0.2 mL H1N1甲型流感病毒液注入尿囊腔內(nèi)。48 h后,無菌操作收集尿囊液。

1.2.2 血凝實驗 倍比稀釋測定血凝效價[3]。

1.2.3 流感病毒的TCID50測定 先將病毒液(效價1∶1 280以上)用維持液2倍比稀釋成10-1～10-9, 將對數(shù)生長期的MDCK細胞按2×104個/孔接種于96孔板，在5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞長滿單層后，棄掉培養(yǎng)液上清，用PBS液洗2次，控干。每孔加稀釋后的病毒液各100 μL，每種濃度重復6孔，同時設(shè)空白孔和正常細胞對照組(細胞對照不加病毒,只加維持液2)。感染1.5 h后，換用維持液1繼續(xù)培養(yǎng)，24、48、72 h時在顯微鏡下觀察CPE情況，直至細胞病變不再繼續(xù)記錄病變程度及孔數(shù)，根據(jù)Karber公式計算病毒的TCID50。

1.2.4 藥物對MDCK細胞的毒性作用 按2×104個/孔細胞數(shù)接種于96孔板，次日，換成不同濃度的含藥維持液(13.5、9、6、4、2.67、1.78 mg/mL)，并設(shè)空白孔和正常細胞對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加MTT 10 μL，置5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩至結(jié)晶完全溶解，置酶標儀波長490 nm測定各孔的OD值，并計算細胞存活率，細胞存活率(%)=(藥物組平均OD值/正常細胞對照組平均OD值)×100%[4]，計算藥物對細胞的最大無毒濃度。

1.2.5 藥物抗病毒作用 用100TCID50的H1N1感染MDCK細胞，設(shè)五加皮水浸液的最大無毒濃度組、病毒對照組和正常對照組共3組，每組均重復6孔，再設(shè)1個空白孔，分別采用3種方式給藥。①預(yù)防給藥組：在貼壁生長的細胞中加入不同濃度的藥液100 L/孔，培養(yǎng)24 h后棄去孔中液體，再加入100TCID50的病毒液，1.5 h后換為相應(yīng)濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對照孔出現(xiàn)最大程度病變?yōu)橹梗虎谥委熃o藥組：細胞先用100TCID50的病毒液感染1.5 h，棄去病毒液后換為相應(yīng)濃度的藥液，繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對照孔出現(xiàn)最大程度病變?yōu)橹?；③直接滅活組：在貼壁生長的細胞中加入五加皮水浸液最大無毒濃度與100TCID50H1N1混合液100 L/孔，培養(yǎng)1.5 h后換維持液繼續(xù)培養(yǎng)至病毒對照孔出現(xiàn)最大程度病變?yōu)橹?。采用MTT法測定病毒對藥物的作用，并計算藥物的抗病毒有效率(ER)[5]。ER=(藥物組A值-病毒對照組A值)/(細胞對照組A值-病毒對照組A值)×100%

2 結(jié)果

2.1 流感病毒H1N1增殖后血凝效價的測定 實驗采用的病毒效價為1∶2 560(見表1)。

表1 H1N1增殖后血凝效價的測定結(jié)果

試管序號1 2 3 4 5 6 7 89 10病毒稀釋度1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120觀察結(jié)果 ++++ ++++ ++++ +++++++++++++++ ++++++血凝滴度 1:2560

2.2 流感病毒H1N1毒力測定(TCID50的測定) 流感病毒H1N1感染后的MDCK細胞表現(xiàn)為細胞變圓、脫落，折光性增強。根據(jù)Karber公式計算得到病毒的TCID50為2.14×10-5(見圖1，表2)。

A:正常細胞;B:CPE現(xiàn)象。 圖1 流感病毒H1N1感染細胞后觀察CPE(×10)

表2流感病毒H1N1毒力測定結(jié)果

病毒稀釋倍數(shù)CPE的程度感染孔數(shù)被感染細胞比例10-1++++66/6=110-2++++66/6=110-3+++66/6=110-4++44/6=0.6710-5+22/6=0.3310-6+11/6=0.1710-7～10-10-00/6=0陰性細胞對照組-00/6=0

2.3 藥物對MDCK細胞的毒性作用 藥物對MDCK的毒性表現(xiàn)為：細胞團縮，變圓，脫落，并且OD值明顯下降。實驗顯示：五加皮水浸液在4 mg/mL至13.5 mg/mL有明顯的細胞毒性(P<0.05,見表3)。

組別藥物濃度(mg/mL)OD值細胞存活率(%)五加皮水浸液13.50.41±0.02* 39.490.66±0.03*63.060.85±0.03*80.840.95±0.03*90.52.671.02±0.03 97.11.781.04±0.03 99.4細胞對照組01.05±0.05100.0

*P﹤0.05 VS 細胞對照組。

2.4 藥物抗病毒作用 根據(jù)藥物對MDCK細胞的毒性作用，選出最大無毒濃度即1.78mg/mL進行抗病毒試驗。實驗顯示五加皮水浸液治療給藥組沒有作用，而預(yù)防給藥及直接滅活病毒組均有效，且預(yù)防給藥組抗病毒有效率達到78.26%，作用較好(見表4)。

組別用藥組OD值病毒對照組OD值細胞對照組OD值ER值(%)預(yù)防給藥組0.95±0.04**0.59±0.041.05±0.0878.26治療給藥組0.41±0.030.51±0.090.80±0.0734.48直接滅活病毒組0.56±0.070.51±0.060.69±0.0327.78

**P﹤0.05 VS 病毒對照組。

3 討論

近年來，新型流感病毒不斷爆發(fā)，給人類健康帶來了嚴重的危害。目前，奧司他韋廣泛用于甲型及乙型流感的治療中。但是隨著臨床用藥的增多，有關(guān)該藥的耐藥性報道也越來越多。中藥在預(yù)防和治療流感的實踐中積累了豐富的臨床經(jīng)驗[6]。中藥五加皮主要的化學成分有苯丙烯酸糖苷、丁香苷、二萜類化合物、本考利烯酸、4-甲基水楊醛、B-谷甾醇、葡萄糖苷、維生素A 和 B1、胸腺嘧啶、次黃嘌呤等, 具有抗應(yīng)激、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、增強免疫等作用[7]。本研究采用五加皮水浸液作為研究對象，研究其抗甲型流感病毒的作用。

實驗通過MTT法檢測五加皮水浸液對MDCK細胞的毒性作用，結(jié)果顯示五加皮水浸液在1.78mg/mL

時對細胞的生長沒有明顯的影響，細胞存活率高達99.4%，所以選用最大無毒濃度1.78mg/mL進行抗病毒實驗。在抗病毒實驗中，我們采用3種給藥方式進行研究，實驗結(jié)果顯示：五加皮水浸液對H1N1型流感病毒的感染具有一定的預(yù)防作用，并且可以直接滅活病毒(預(yù)防給藥組ER為78.26%，直接滅活病毒組ER為27.78%)，治療給藥組對H1N1完全沒有效果，推測該藥主要作用于沒有進入細胞內(nèi)的病毒，可以阻止病毒的吸附，而對細胞內(nèi)病毒沒有作用。因此，我們認為五加皮可以用于流感的預(yù)防，但其直接殺病毒及預(yù)防作用機制還有待進一步研究。

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