硫酸鋅預(yù)處理對大鼠心臟缺血/再灌注損傷心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

張永國 ，侯偉波，王 穎，王海英，喻 田

(遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉系，貴州 遵義 563099)

鋅作為機體內(nèi)重要的細胞內(nèi)信號分子，在信號識別、第二信使代謝、蛋白激酶、激活磷酸化等方面發(fā)揮著重要作用[1]。體外循環(huán)下血鋅下降及鋅在機體內(nèi)再分布都將加重再灌注期心肌損傷，而補充外源性鋅可減輕心肌缺血再灌注損傷，其機制尚未明確[2-3]。本實驗通過建立Langendorff 離體心臟缺血再灌注模型，觀察硫酸鋅預(yù)處理對缺血/再灌注離體心臟超微結(jié)構(gòu)及線粒體評分的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠40只，體重250～300g,8～9周齡，購于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心(證書號：SCXK(渝)2013——0005)。

1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉(美國Sigma公司 )，肝素鈉(北京Solarbio科技有限公司分裝)，硫酸鋅(美國Sigma公司 )，實驗所用灌流液為Krebs—Henseleit(K-H)液，其成分(單位mmol·L-1)NaC1 118.0，KC1 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，NaHCO325.0，CaC121.25，Glucose 10.0。ST.Thomas停跳液(成分單位：mmol·L-1)NaC1 110.0，KC1 16.00, CaC121.20,MgCl216.00, NaHCO310.00。

1.3 主要儀器 Langendorff灌注裝置、Powerlab生物信號采集系統(tǒng)，透射電子顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組與模型的建立 以隨機數(shù)字表法將SD大鼠40只隨機分為4組，每組10只，即正常組(N組)、缺血/再灌注組(C組)、硫酸鋅預(yù)處理組(Zn組)、缺血預(yù)處理組(IPC)。硫酸鋅預(yù)處理組采用3.6%硫酸鋅，1.5 mL·kg-1予大鼠腹腔注射，其余各組采用三蒸水予大鼠腹腔注射(1.5 mL·kg-1)。24 h后，將大鼠麻醉(肝素250 U·kg-1、1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1,腹腔注射)并且固定，迅速開胸取心臟置于K-H液中(4 ℃，pH值為7.35～7.45)，排除血液，固定主動脈于Langendorff 灌注針，充氧后K-H液(37 ℃，pH值為7.35～7.45)持續(xù)逆行灌注，剪開肺動脈以降低肺動脈壓力，同時去除左心耳，將球囊傳感器沿左心房插入左心室并固定，調(diào)整灌注壓在70～80 mmHg,左室舒張末壓在4～8 mmHg,平衡20 min后，建模標準為：心率>250次/min、左室發(fā)展壓≥80 mmHg、室性早博≤3個/min。各組模型灌注方式(見表1)。

表1各組大鼠離體心臟灌注方案及時程(min)

R10s/I10s 即缺血10S，再灌注10s，循環(huán)6次。

1.4.2 各組電鏡標本的取材和制備[4]各組標本在離體灌注結(jié)束后，迅速將左心室取1 mm3大小的組織5～8塊，盛于預(yù)冷3%戊二醛固定液管里，放在4℃冰箱里2h,即完成標本的固定。然后再進行標本進一步的固定、脫水、包埋，完成超薄切片，行透射電子顯微鏡下觀察，同時選取10個視野觀察，留取電鏡圖片。

1.4.3 線粒體Flameng評分方法 每個電鏡標本中隨機選擇5個視野，每個視野隨機選擇20個線粒體，使線粒體觀察總數(shù)達到100個，將觀察到的每個線粒體損害程度按0～4級計分，最后將100個線粒體所得總分除以100，即為該標本得分數(shù)值，分值越高，說明線粒體的損害越嚴重。評分標準參照Flameng分級[5]，分0到4級，1～4級分別為1～4分。分值大小與線粒體損傷程度呈正比，評分標準參照Flameng分級(見表2)。

表2 Flameng線粒體評分標準

分級損害程度分值(分)0級線粒體結(jié)構(gòu)正常,充滿顆粒01級線粒體結(jié)構(gòu)正常,但顆粒缺乏12級線粒體腫脹,基質(zhì)透明23級線粒體嵴分裂,伴基質(zhì)透明和濃聚34級線粒體嵴分裂,基質(zhì)丟失,線粒體4內(nèi)外膜完整性缺失,呈空泡狀

2 結(jié)果

2.1 超微結(jié)構(gòu)改變 各組心肌組織的超微結(jié)構(gòu)改變(見圖1)。N組的心肌結(jié)構(gòu)清楚，肌絲排列整齊，未見溶解和斷裂，肌節(jié)清晰可見，長度均一，M線、Z線清楚，胞漿內(nèi)線粒體數(shù)量較多，排列整齊，形態(tài)完整，嵴清晰可見，肌漿網(wǎng)形態(tài)正常，部分肌絲溶解，個別線粒體腫脹。C組心肌細胞水腫明顯，肌節(jié)長短不一，肌絲排列紊亂，局部肌絲甚至出現(xiàn)斷裂和溶解；細胞核膜有破裂，核染色質(zhì)固縮邊聚；線粒體腫脹，其嵴排列紊亂，呈絮狀、溶解、斷裂、或者成空泡樣改變，其膜有破裂；肌質(zhì)網(wǎng)擴張，其膜也有破裂。Zn組和IPC組心肌超微結(jié)構(gòu)較C組有明顯改善，心肌結(jié)構(gòu)清晰，肌絲排列尚整齊，小部分肌絲溶解，部分肌節(jié)破壞，胞漿內(nèi)線粒體數(shù)量較多，大多數(shù)線粒體形態(tài)完整，嵴清晰可見，部分有輕度腫脹，視野內(nèi)有少量線粒體碎片，肌漿網(wǎng)基本正常。

A：正常組；B：缺血組；C：硫酸鋅預(yù)處理組；D：缺血預(yù)處理組。圖1 各組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變電鏡圖片(標尺1μm,×20000)

2.2 各組心肌細胞線粒體的評分 采用經(jīng)典的Flameng線粒體評分方法對4組大鼠心肌進行線粒體評分，各組分值結(jié)果顯示，C組的線粒體評分分值為3.00±0.53，較其余3組高，Zn組和IPC組的評分分別為1.08±0.17和1.10±0.11，均低于C組，有明顯差異，與N組的評分分值比較無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間比較也無統(tǒng)計學(xué)意義(見表3)。結(jié)果顯示(見圖2)。

分組線粒體評分值N0.96±0.18C 3.00±0.53*Zn 1.08±0.17#IPC 1.10±0.11#

與N組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

與N組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。圖2 各組線粒體評分結(jié)果(n=100)

3 討論

臨床工作中遇到的心血管疾病，其常見病理生理變化過程即是心肌缺血再灌注損傷。需要觀察再灌注對心肌細胞造成嚴重損傷程度，可以根據(jù)心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變來判斷[6]。心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機制復(fù)雜，包括諸多因素，其中較公認的是氧自由基損傷[1]。

研究認為，缺血預(yù)處理是缺血心臟有效的內(nèi)源性保護現(xiàn)象[7]，但缺血預(yù)處理在臨床應(yīng)用仍存限制因素，對心臟有創(chuàng)性，尚未成為一項常規(guī)[8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，給予適當(dāng)?shù)乃幬镱A(yù)處理也能達到類似的保護效果[9]。由于藥物預(yù)處理具有較好的可控性，且無創(chuàng)傷性，故有利于預(yù)處理的實際推廣應(yīng)用。體外循環(huán)下,鋅離子水平下降以及在機體內(nèi)再分布都將加重再灌注期心肌損傷，而補充外源性鋅可減輕心肌缺血再灌注損傷，但其機制還未明確。為進一步明確硫酸鋅預(yù)處理對缺血再灌注大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)及線粒體評分的影響，對比觀察硫酸鋅預(yù)處理與缺血預(yù)處理兩種方式對缺血再灌注損傷大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)變化，分析硫酸鋅預(yù)處理能否與缺血預(yù)處理有同樣的心肌保護作用，為探討預(yù)處理心肌保護機制，以及藥物替代 的可能性，為臨床抗心肌缺血再灌注損傷提供更便利的方法，特設(shè)計本實驗。

心肌缺血再灌注損傷并不是心肌缺血本身所導(dǎo)致的結(jié)果，而是受到再灌注期間細胞周圍環(huán)境的影響，線粒體功能障礙是導(dǎo)致心肌細胞功能和活性受損的決定性因素，同時也是缺血再灌注眾多炎癥因子激活的各種細胞通路的重要靶作用部位[10-11]。故可以通過觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)改變以及線粒體評分來反應(yīng)心肌缺血再灌注損傷的病理變化[12]，本實驗采用高分辨率電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，缺血/再灌注組與正常組相比較，其超微結(jié)構(gòu)的改變?yōu)椋杭〗z明顯排列紊亂、溶解、消失，潤盤結(jié)構(gòu)不清，線粒體高度腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊，大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡形成，缺血/再灌注組的線粒體Flameng評分明顯高于正常組(P<0.05)，表明缺血/再灌注過程可對心肌細胞超微結(jié)構(gòu)造成嚴重損傷。而硫酸鋅預(yù)處理組與缺血預(yù)處理組的心肌超微結(jié)構(gòu)顯示，只有少部分肌絲斷裂，潤盤結(jié)構(gòu)稍模糊，線粒體稍腫脹，嵴結(jié)構(gòu)較清晰，少部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成空泡，且兩組Flameng評分結(jié)果與正常組比較沒有明顯差異(P=1.00),而明顯低于缺血/再灌注組(P<0.05)。由此從形態(tài)學(xué)角度可推斷出硫酸鋅預(yù)處理能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，即對缺血再灌注心肌超微結(jié)構(gòu)具有保護作用。由此可見，硫酸鋅預(yù)處理與缺血預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有相似的保護作用，且提示硫酸鋅預(yù)處理能夠模擬缺血預(yù)處理的心肌保護作用。但是這兩種預(yù)處理方式的心肌保護作用具體機制有待進一步探索研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明缺血/再灌注可對心肌細胞超微結(jié)構(gòu)造成嚴重損傷，硫酸鋅預(yù)處理可替代缺血預(yù)處理減輕再灌注所致心肌細胞超微結(jié)構(gòu)損傷，以及線粒體評分數(shù)值較低即線粒體損傷較小，由此可推測出硫酸鋅預(yù)處理大鼠心臟可產(chǎn)生心肌保護作用。

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