2種蝴蝶蘭組織培養(yǎng)快繁技術

宋微+潘靜霞+吳靜

摘要：以紅龍、皇帝2個品種的蝴蝶蘭花梗為材料，1/3MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，篩選花梗使用HgCl2消毒的最佳時間，增殖培養(yǎng)基的最佳激素、蔗糖濃度，以確立最佳培養(yǎng)配方。結果表明，紅龍、皇帝品種最佳的誘導材料為開過花的花梗；紅龍品種的最佳消毒時間為20 min，皇帝品種的最佳消毒時間為18 min；適合紅龍品種生長的最佳激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，蔗糖濃度為25 g/L；適合皇帝品種生長的最佳激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，蔗糖濃度為20 g/L。

關鍵詞：蝴蝶蘭；組織培養(yǎng)；消毒時間；激素

中圖分類號： Q943.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0055-02

收稿日期：2013-09-02

基金項目：江蘇省自然科學基金（編號：BK2011498、BK2010345）；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術學院課題。

作者簡介：宋微（1978—），女，黑龍江大慶人，博士，副教授，從事植物組織培養(yǎng)、微生物和植物病理學研究。E-mail：13360790@qq.com。蝴蝶蘭（Phalaenopsis amabilis）系蘭科蝴蝶蘭屬植物，花大而美麗，花期長，品種多，栽培廣泛，深受人們喜愛，在花卉市場上常常供不應求。在自然條件下，蝴蝶蘭主要靠分株、種子繁殖，繁殖率低，而且由于長期進行有性繁殖，帶病毒株增多，逐漸使種性降低，影響生長。如今組織培養(yǎng)已經(jīng)成為蝴蝶蘭無性繁殖最常用的方法，既可以保持母本的優(yōu)良性狀，快速繁殖子代，又可以反季節(jié)栽培適應市場需求[1-4]。以花梗芽作為外植體進行培養(yǎng)是代替蝴蝶蘭莖尖培養(yǎng)的一種方法[1]，在不影響蝴蝶蘭母株的優(yōu)良性狀和經(jīng)濟條件下選取外植體，提高花梗芽的誘導率，避免病毒擴散和危害，保持母株優(yōu)良的生物學特性[2]。本研究以花梗芽為外植體，篩選最佳快繁培養(yǎng)基，研究紅龍（Phalaenopsis amabilis “Red Dragon”）、皇帝（Phalaenopsis amabilis “Emperor”）2個品種的最佳培養(yǎng)方案，為這2個品種的快速繁育提供必要的技術支持。

1材料與方法

1.1材料

分別取蝴蝶蘭紅龍、皇帝2個品種開過花的花梗，除基部外至頂端第6節(jié)至第7節(jié)剝開可見到芽的部位為組織培養(yǎng)的外植體材料，每個樣本100個，重復3次。

1.2方法

1.2.1清洗與消毒從溫室里取出材料后用流水沖洗1 h，加入3%的洗衣粉，取生長時間超過40 d的花梗，提前把苞葉剝去后用于接種[5-7]。以75%乙醇棉球擦拭花梗表面，放在無菌操作臺上備用，以節(jié)為單位切成段，每節(jié)段上端留2 cm，下端留3 cm。以解剖刀除去花梗節(jié)芽上的苞葉，去除節(jié)段表面病斑、焦枯部分[2]。以75%乙醇棉球重復擦拭去苞葉的花梗芽，力度適中，防止傷芽。以75%乙醇振蕩浸泡30 s，而后以0.1% HgCl2消毒，消毒時間分別采用8、10、12、14、16、18、20 min，再以無菌水振蕩沖洗3次，用解剖刀切去消毒后花梗兩端各0.5 cm，以芽自然生長方向正向插入培養(yǎng)基內[8]。

1.2.2培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+20g/L蔗糖；增殖培養(yǎng)基為1/3MS+7 g/L瓊脂+1、2、3、4、5 mg/L 6-BA+0.1、0.2、03、0.4、0.5 mg/L NAA+5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖，pH值為6.8。組培瓶內培養(yǎng)基為100 mL/瓶，分裝后于121 ℃下滅菌21 min，備用。恒溫26 ℃培養(yǎng)，光照時間為10～12 h/d，光照強度為1 600～2 000 lx。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗所得的數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件統(tǒng)計分析。

2個品種蝴蝶蘭以0.1%HgCl2消毒8 min的外植體污染率均最高，分別為76.7%、93.3%。隨著消毒時間的延長，外植體污染率降低，當消毒時間延長至20 min時，紅龍污染率為16.6%，皇帝污染率為16.7%，但芽同時出現(xiàn)毒死現(xiàn)象，芽死亡率為6.7%，致使萌芽率降低，所以不同品種的消毒時間存在著差異。由此可見，紅龍的最佳消毒時間為20 min，皇帝的最佳消毒時間為18 min，此消毒時間根據(jù)花梗芽的飽滿成熟度有所不同。

表1不同消毒時間對紅龍和皇帝2個品種萌發(fā)的影響

滅菌時間

（min）污染率（%）死亡率（%）萌發(fā)率（%）紅龍皇帝紅龍皇帝 紅龍皇帝876.693.30010.0 3.3 1073.383.30020.010.0 1263.380.00043.316.6 1450.056.60040.0 40.01643.346.60050.056.6 1826.620.00070.083.3 2016.616.70 6.7 86.6 66.6 注：培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+20 g/L 蔗糖。

2.2不同濃度的外源激素對花梗誘導和叢生芽產(chǎn)生的影響

經(jīng)過40 d培養(yǎng)后，由表2可知，當激素組合為1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA時，紅龍、皇帝平均芽長為1.56、1.92 cm，且其平均芽長隨著6-BA、NAA濃度的增加而變長。當激素組合為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA時，紅花、皇帝叢生芽的平均長度達到最長，為3.04、2.67 cm。說明紅龍和皇帝組培的最佳激素組合均為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

不同激素組合對2個品種叢生芽誘導的影響

激素濃度（mg/L）誘導率（%）平均芽長（cm）6-BANAA紅龍皇帝紅龍皇帝10.120.0a95.6a1.56a1.92a20.240.0b96.6a1.65a1.98a30.360.0b97.2a2.41b2.49b40.470.0c97.2a2.42b2.58b50.576.6d100.0b3.04c2.67c注：同列數(shù)據(jù)后不同字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.3不同蔗糖濃度對芽長和叢生芽的影響

在植物組織培養(yǎng)中，尤其是在蝴蝶蘭快繁中，主要把蔗糖作為碳源，不同的蔗糖濃度對叢生芽的產(chǎn)生和芽長有很大的差異[9]。本試驗對紅龍和皇帝2個品種分別用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖進行處理，結果見表3。從表3可看出，當蔗糖濃度為25 g/L時，紅龍品種的平均芽長最長，為3.0 cm，叢生芽平均個數(shù)為1.3個。當蔗糖濃度為20 g/L時，皇帝的平均芽長最長，為2.9 cm，叢生芽平均個數(shù)為2.3個。說明適合蝴蝶蘭紅龍、皇帝品種的最佳蔗糖濃度分別為25、20 g/L。

不同蔗糖濃度對叢生芽生長的影響

蔗糖濃度

（g/L）紅龍皇帝誘導率

（%）平均芽長

（cm）叢生芽

平均個數(shù)誘導率

（%）平均芽長

（cm）叢生芽

平均個數(shù)5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3結論

許多研究結果表明，花梗是蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最佳外植體，植物生長激素濃度、蔗糖濃度等都是影響休眠芽萌發(fā)的關鍵因素[4，8，10]。筆者發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度會直接影響蝴蝶蘭不同品種的增殖率，不同品種的外植體也要進行不同時間的消毒，否則會提高污染率或毒殺芽體。

綜上所述，紅龍的最佳消毒時間為20 min，皇帝最佳的消毒時間是18 min，適合蝴蝶蘭紅龍組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，適合蝴蝶蘭皇帝組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+20 g/L蔗糖。

參考文獻：

[1]劉翠蘭，王小芳，李雙云，等. 蝴蝶蘭花梗芽的組織培養(yǎng)[J]. 山東林業(yè)科技，2004（4）：37.

[2]張偉，曾伏虎，張?zhí)K鋒. 蝴蝶蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J]. 信陽師范學院學報：自然科學版，2004，17（3）：335-337.

[3]林漢銳，鐘融融，洪生標，等. 蝴蝶蘭新品種滿天紅的特征特性及栽培技術[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2003（2）：11-12.

[4]胡松華. 蝴蝶蘭[M]. 廣州：廣東科學技術出版社，2001.

[5]潘學峰，王安石，李海珠. 蝴蝶蘭組培快繁技術的研究進展[J]. 熱帶林業(yè)，2005，33（1）：45-47.

[6]周俊彥，郭扶興. 細胞分裂素類物質在植物體細胞胚發(fā)生中的作用[J]. 植物生理學通訊，1996，32（4）：247-253.

[7]李進進，廖俊杰，柯麗婉，等. 蝴蝶蘭根段的組織培養(yǎng)[J]. 植物生理學通訊，2000，36（1）：37.

[8]魯雪華，郭文杰，徐立暉，等. 蝴蝶蘭花梗節(jié)間段培養(yǎng)繁殖的初步研究[J]. 園藝學報，2002，29（5）：491-492.

[9]王蒂. 植物組織培養(yǎng)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[10]李浚明，編譯. 植物組織培養(yǎng)教程[M]

2.3不同蔗糖濃度對芽長和叢生芽的影響

在植物組織培養(yǎng)中，尤其是在蝴蝶蘭快繁中，主要把蔗糖作為碳源，不同的蔗糖濃度對叢生芽的產(chǎn)生和芽長有很大的差異[9]。本試驗對紅龍和皇帝2個品種分別用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖進行處理，結果見表3。從表3可看出，當蔗糖濃度為25 g/L時，紅龍品種的平均芽長最長，為3.0 cm，叢生芽平均個數(shù)為1.3個。當蔗糖濃度為20 g/L時，皇帝的平均芽長最長，為2.9 cm，叢生芽平均個數(shù)為2.3個。說明適合蝴蝶蘭紅龍、皇帝品種的最佳蔗糖濃度分別為25、20 g/L。

不同蔗糖濃度對叢生芽生長的影響

蔗糖濃度

（g/L）紅龍皇帝誘導率

（%）平均芽長

（cm）叢生芽

平均個數(shù)誘導率

（%）平均芽長

（cm）叢生芽

平均個數(shù)5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3結論

許多研究結果表明，花梗是蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最佳外植體，植物生長激素濃度、蔗糖濃度等都是影響休眠芽萌發(fā)的關鍵因素[4，8，10]。筆者發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度會直接影響蝴蝶蘭不同品種的增殖率，不同品種的外植體也要進行不同時間的消毒，否則會提高污染率或毒殺芽體。

綜上所述，紅龍的最佳消毒時間為20 min，皇帝最佳的消毒時間是18 min，適合蝴蝶蘭紅龍組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，適合蝴蝶蘭皇帝組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+20 g/L蔗糖。

參考文獻：

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[10]李浚明，編譯. 植物組織培養(yǎng)教程[M]

2.3不同蔗糖濃度對芽長和叢生芽的影響

在植物組織培養(yǎng)中，尤其是在蝴蝶蘭快繁中，主要把蔗糖作為碳源，不同的蔗糖濃度對叢生芽的產(chǎn)生和芽長有很大的差異[9]。本試驗對紅龍和皇帝2個品種分別用5、10、15、20、25、30 g/L蔗糖進行處理，結果見表3。從表3可看出，當蔗糖濃度為25 g/L時，紅龍品種的平均芽長最長，為3.0 cm，叢生芽平均個數(shù)為1.3個。當蔗糖濃度為20 g/L時，皇帝的平均芽長最長，為2.9 cm，叢生芽平均個數(shù)為2.3個。說明適合蝴蝶蘭紅龍、皇帝品種的最佳蔗糖濃度分別為25、20 g/L。

不同蔗糖濃度對叢生芽生長的影響

蔗糖濃度

（g/L）紅龍皇帝誘導率

（%）平均芽長

（cm）叢生芽

平均個數(shù)誘導率

（%）平均芽長

（cm）叢生芽

平均個數(shù)5901.20.9922.21.610801.20.8901.51.515501.80.5802.31.420902.70.91002.92.3251003.01.3902.51.930302.70.3802.81.5

3結論

許多研究結果表明，花梗是蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的最佳外植體，植物生長激素濃度、蔗糖濃度等都是影響休眠芽萌發(fā)的關鍵因素[4，8，10]。筆者發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度會直接影響蝴蝶蘭不同品種的增殖率，不同品種的外植體也要進行不同時間的消毒，否則會提高污染率或毒殺芽體。

綜上所述，紅龍的最佳消毒時間為20 min，皇帝最佳的消毒時間是18 min，適合蝴蝶蘭紅龍組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+7 g/L瓊脂+25 g/L蔗糖，適合蝴蝶蘭皇帝組培快繁的最佳培養(yǎng)基為1/3MS+5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+ 7 g/L 瓊脂+20 g/L蔗糖。

參考文獻：

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[10]李浚明，編譯. 植物組織培養(yǎng)教程[M]