補腎柔肝方對肝纖維化大鼠肝組織病理學以及α-SMA蛋白表達的影響

鄭亞江，周振華，任 朦，祝峻峰

(1. 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2. 上海市曙光醫(yī)院，上海 201203)

補腎柔肝方對肝纖維化大鼠肝組織病理學以及α-SMA蛋白表達的影響

鄭亞江1，周振華2，任 朦1，祝峻峰1

(1. 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2. 上海市曙光醫(yī)院，上海 201203)

目的 觀察補腎柔肝方對肝纖維化大鼠肝組織病理學的影響。方法 SD大鼠隨機分為空白對照組8只、模型組15只、秋水仙堿組15只、補腎柔肝方組15只。均以標準鼠食飼養(yǎng),自由飲水,除空白對照組外，其余各組大鼠采用CCl4造模8周制備肝纖維化模型。從第9周開始，秋水仙堿組、補腎柔肝方組灌胃相應藥物，空白對照組、模型組灌胃等體積生理鹽水，均連續(xù)灌胃8周。末次給藥后2 h，取肝組織進行HE、天狼猩紅染色，評價肝細胞變性與膠原纖維增生程度。分別采用RT-PCR法和蛋白印跡法檢測肝組織α-SMA表達情況。結果 補腎柔肝方組大鼠肝臟的纖維化程度明顯低于模型組；與空白對照組相比，模型組大鼠的α-SMA蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，秋水仙堿組及補腎柔肝方組α-SMA蛋白表達水平有所降低(P均<0.05)。結論 補腎柔肝方能夠降低大鼠肝臟內α-SMA蛋白的表達水平，具有明確的抗肝纖維化作用。

補腎柔肝方；肝纖維化大鼠；α-SMA蛋白

肝纖維化(LF)是肝細胞發(fā)生壞死或炎癥刺激時，因細胞外基質(ECM)合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過程，是涉及復雜的細胞及分子機制的動態(tài)過程。LF是各種慢性肝病重要的病理特征，也是進一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)，若病因持續(xù)存在，肝小葉及血管等逐漸被改建，肝臟的正常結構遭到破壞，中心靜脈區(qū)和匯管區(qū)出現(xiàn)間隔、假小葉形成，即發(fā)展為不可逆轉的肝硬化[1-2]。補腎柔肝方是根據(jù)中醫(yī)關于肝纖維化“脾腎虧虛、瘀血阻絡”的病機，由仙靈脾、炙鱉甲、丹參等藥物組成的經驗方，是治療慢性肝病肝纖維化較為安全、有效的中藥復方。本實驗通過觀察肝纖維化大鼠肝組織學的改變，旨在明確補腎柔肝方對肝纖維化大鼠肝組織病理學的影響。

1 實驗資料

1.1 實驗材料 補腎柔肝方，由上海中醫(yī)藥大學曙光醫(yī)院制劑室提供，水浴蒸發(fā)至每毫升含生藥3.5 g的流浸膏；秋水仙堿，云南植物藥業(yè)有限公司生產，產品編號01420249708；α-SMA，Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA批號：sc-53142；RT-PCR試劑盒，Thermo公司K0241；輪轉切片機(RM2035)；HI1220烤片機，德國Leica公司；LEICA EG1160 石蠟包埋機。

1.2 動物及分組 雄性Wistar 大鼠53只，清潔級，體質量180～200 g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2008-0015。動物隨機分為空白對照組8只、模型組15只、秋水仙堿組15只、補腎柔肝方組15只。

1.3 模型制備及動物處理 實驗開始時，除空白對照組外，其余各組大鼠首次于背部皮下注射純CCl45 mL/kg，3 d后皮下注射40% CCl4花生油3 mL/kg，每周2次，而空白對照組首次注射等體積的生理鹽水，以后皮下注射花生油3 mL/kg，造模8周。從第9周開始秋水仙堿組給予秋水仙堿水溶液5 mL/(kg·d)灌胃，補腎柔肝方組給予補腎柔肝方流浸膏5 mL/(kg·d)灌胃，空白對照組、模型組則給予同等體積生理鹽水灌胃，均連續(xù)8周。實驗期間所有大鼠標準飲食。末次給藥后，禁食24 h，在乙醚麻醉、無菌無熱源條件下，從大鼠腹主動脈采血，注入無熱源玻璃試管中，3 000 r/min 4 ℃離心20 min，吸出血漿置于玻璃試管中封口，于-80 ℃低溫保存。摘除肝臟、脾臟、腎臟，用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干多余水分，稱質量，計算肝、脾、腎臟指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質量(g)/個體質量(g)×100%。每只大鼠取相同部位肝臟用甲醛固定，其余部分肝臟-80 ℃低溫冰箱保存，以備病理檢查和免疫組化檢測。

1.4 檢測指標

1.4.1 肝組織病理染色 將肝組織立即固定于4%多聚甲醛緩沖液，24內石蠟包埋，4 μm切片，分別行HE、天狼猩染色。鏡檢觀察肝細胞變性、膠原纖維增生程度。

1.4.2 RT-PCR法檢測肝組織中α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達 TRIzol法提取肝組織總RNA，進行RT-PCR擴增，引物設計采用bioinformatics軟件。PCR反應參數(shù)：94 ℃預變性7 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。取上述反應產物6 μL于1.0%含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Maker(DL2000)作為標準分子量標記，電泳后用紫外透射儀觀察，并用數(shù)碼照相機照相，輸入微機應用法國VL公司BIO-PROFIF凝膠圖像分析系統(tǒng)對目的電泳條帶進行分析，以相應的內參(GAPDH)電勇條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.4.3 蛋白印跡法檢測肝組織中α-SMA的表達 取100 mg肝組織置于1 mL組織勻漿緩沖液(20 mmol/L氯化鈉,1%NonidetP40，0.1%十二烷基硫酸鈉，50 mmol/L三氨基甲烷，5 mmol/L乙二胺四乙酸，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1%蛋白酶抑制劑)中勻漿，測定總蛋白含量。取30 μg總蛋白含量的裂解液進行10%SDS-PAGE變性凝膠電泳。經硝酸纖維素膜轉移。脫脂奶粉封閉，分別與特異性α-SMA(濃度均為1∶200)孵育，洗滌，再以辣根過氧化物酶耦聯(lián)的第二抗體作用，反應信號經化學熒光底物發(fā)光，X射線片曝光。并以計算機圖像掃描圖像分析，測定灰度值。以同一張蛋白印跡膜曝光后以0.5%十二烷基硫酸鈉洗脫，再以GAPDH孵育雜交，作為內參照。每個實驗重復3批以上不同樣本。

2 結 果

2.1 大鼠一般情況比較 空白對照組大鼠生長狀態(tài)良好，體質量增加顯著，皮毛光滑，二便如常；模型組大鼠活動少，精神萎靡，胡須下垂，喜睡少動，體質量增加減少，甚至較前下降，皮毛不光滑，尿色黃，量偏少，大便次數(shù)增多，2～3次，不成形；秋水仙堿組大鼠生活狀態(tài)好于模型組，體質量增加減少，皮毛欠光滑；補腎柔肝方組大鼠一般狀態(tài)明顯好于模型組。在8周的治療過程中，空白對照組大鼠無死亡，而模型組大鼠死亡4只，補腎柔肝方組死亡1只，秋水仙堿組死亡1只。

2.2 各組肝纖維化大鼠器官指數(shù)比較 與空白對照組相比，模型組大鼠肝脾指數(shù)均明顯上升(P均<0.01)，腎指數(shù)無明顯變化；與模型組相比，秋水仙堿組肝指數(shù)下降(P<0.05)，脾指數(shù)無變化；而補腎柔肝方組肝脾指數(shù)均明顯下降(P均<0.05)。見表1。

表1 各組肝纖維化大鼠器官指數(shù)比較±s，%)

注：①與空白對照組比較，P<0.01；②與模型組比較，P<0.05；③與模型組比較,P<0.01。

2.3 各組肝組織病理學表現(xiàn)

2.3.1 HE染色 光鏡下觀察可見，空白對照組大鼠肝組織未見明顯變化，肝細胞條索排列整齊，未見明顯變性、壞死，肝實質內未見明顯炎癥細胞浸潤，見圖1。模型組大鼠肝組織內大部分小葉結構受到破壞，纖維結締組織增生，假小葉形成，肝組織大片壞死呈空網狀，其間可見脂肪變性，增生的纖維組織中可見大量炎性細胞浸潤，見圖2。補腎柔肝方組和秋水仙堿組大鼠肝組織可見局灶性壞死，匯管區(qū)纖維組織增生，形成小的條索，有少許炎性細胞浸潤，有散在的假小葉形成，脂肪變性比較輕，見圖3和圖4。

2.3.2 天狼猩紅染色 空白對照組肝組織正常，見圖5。模型組大鼠肝臟正常肝小葉結構消失，伴有明顯的纖維結締組織增生，形成典型的假小葉結構，見圖6。而秋水仙堿組及補腎柔肝方組大鼠肝臟的纖維化程度明顯低于模型組，見圖7及圖8。

圖1 空白對照組肝組織HE染色表現(xiàn)

圖2 模型組肝組織HE染色表現(xiàn)

圖3 秋水仙堿組肝組織HE染色表現(xiàn)

圖4 補腎柔肝方組肝組織HE染色表現(xiàn)

圖5 空白對照組天狼猩紅染色表現(xiàn)

圖6 模型組天狼猩紅染色表現(xiàn)

圖7 秋水仙堿組天狼猩紅染色表現(xiàn)

圖8 補腎柔肝方組天狼猩紅染色表現(xiàn)

2.4 各組肝臟 α-SMA mRNA表達情況 空白對照組、模型組、秋水仙堿組、補腎柔肝方組肝臟α-SMA表達值分別為0.5±0.18，3.2±0.17，1.81±0.11，1.83±0.13。與空白對照組相比，模型組大鼠的α-SMA蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，秋水仙堿組及補腎柔肝方組α-SMA蛋白表達水平有所降低(P均<0.05)。

2.5 蛋白印跡法示各組肝臟α-SMA蛋白表達情況 見圖9。

0為空白對照組；1為模型組；2為補腎柔肝方組；3為秋水仙堿組

3 討 論

肝星狀細胞(HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。激活后的HSC除了細胞的表型發(fā)生改變―轉化為肌成纖維細胞(MFB)外，還表達大量的特異性標志蛋白α-SMA，因此α-SMA 被認為是肌成纖維細胞的特異性標志物。檢測α-SMA 在肝組織中的表達可以反映HSC的活化情況，也是評估肝纖維化程度的重要指標之一[1-2]。

作為各種慢性肝損傷共有的病理組織變化，肝纖維化是慢性肝病進一步發(fā)展為肝硬化的必經階段。從肝纖維化到肝硬化是一個緩慢漸進的過程，若能早期發(fā)現(xiàn)并予有效治療，肝纖維化是可以被逆轉的。但迄今尚無安全、高效、理想的抗肝纖維化藥物。因此尋求療效可靠的藥物和治療方案是亟待解決的問題。

中醫(yī)認為肝纖維化是一個動態(tài)變化的病理過程，其病因病機多沿“濕-熱-毒-瘀-虛”發(fā)展。本實驗中所用的補腎柔肝方系王靈臺教授從醫(yī)數(shù)十年摸索總結而成，方中仙靈脾功專補腎益精，“專壯腎陽”(《本草正義》)，“真陽不足者宜之”(《本草綱目》)。炙鱉甲滋陰潛陽、軟堅散結,“主心腹瘕癥堅積”(《神農本草經》)，可“去血氣、破結、惡血”(《日華子本草》)，二藥共用為君。丹參祛瘀生新而不傷正，“主心腹邪氣……破癥除瘕”《(神農本草經)》，“能破宿血，補新血”《(本草綱目)》，“專入血分，其功在活血行血，內之達臟腑而化瘀滯，故積聚消而瘕破”(《本草正義》)，為臣；苦參苦寒入肝，既可清肝利膽，又能燥濕利尿導濕外出，使?jié)駸岜M則黃疸清，為佐。諸藥合用，陰陽互求，補腎而不膩脾，活血而不出血，清肝而不伐肝，共奏補腎填精、活血軟堅、清肝利膽之功。全方組方配伍緊湊，藥專而力宏，攻補兼施，攻而不破，補而不膩，攻補力量較為平均，是治療慢性肝病肝纖維化脾腎虧虛兼血瘀的有效中藥處方。

在以往的一系列臨床和實驗研究中均證實補腎柔肝方能明顯改善HA、PⅢP、LN等指標，下調CTGF和Ⅰ型膠原的表達，可以使HSC的活化得到抑制[3-6]。肝組織病理學檢查是確診肝纖維化最可靠最直接的方法。經補腎柔肝方治療后，大鼠肝組織可見局灶性壞死，匯管區(qū)纖維組織增生，形成小的條索，有少許炎性細胞浸潤，有散在的假小葉形成，脂肪變性比較輕，纖維化程度明顯低于模型組，說明補腎柔肝方可顯著減輕肝組織纖維化的程度和范圍，具有明確的抗纖維化的作用。本研究RT-PCR檢測結果顯示：與空白對照組相比，模型組大鼠的α-SMA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，秋水仙堿組及補腎柔肝方組α-SMA水平有所降低(P<0.05)；蛋白印跡法結果顯示：模型組大鼠肝組織中α-SMA表達量明顯上調，秋水仙堿組及補腎柔肝方組α-SMA的表達呈下降趨勢，提示補腎柔肝方可降低α-SMA表達,抑制HSC活化和增殖，減少肝內纖維組織增生可能是其發(fā)揮抗肝纖維化作用主要機制之一。

[1] Dong R,Luo Y,Zheng S. α-SMA overexpression associated with increased liver fibrosis in infants with biliary atresia[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr,2012,55(6):653-656

[2] Mak KM,Chu E,Lau KH,et al. Liver fibrosis in elderly cadavers:localization of collagen types Ⅰ,Ⅲ and Ⅳ,α-smooth muscle actin,and elastic fibers[J]. Anat Rec (Hoboken),2012,295(7):1159-1167

[3] 張斌,萬莫彬,王靈臺. 補腎柔肝方治療大鼠肝纖維的實驗研究[J]. 中西醫(yī)結合學報,2005,3(2):132-135

[4] 扈曉宇,陳云鳳,王靈臺. 靈甲柔肝方治療慢性乙型肝炎后肝硬化43例[J]. 中醫(yī)研究,2005,18(6):28-30

[5] 張斌,王靈臺. 補腎柔肝方對二甲基亞硝安誘導大鼠肝纖維化的預防作用以及其作用機制[J]. 中西醫(yī)結合學報,2008,6(9):934-937

[6] 張斌,王靈臺. 補腎柔肝方對二甲基亞硝胺誘導大鼠肝纖維化后CTGFmRNA表達的影響[J]. 世界華人消化雜志,2008,16(20):2224-2228

Effect of Bushen Rougan decoction on pathology of liver tissue and expression of α-SMA in rats with liver fibrosis

Zheng Yajiang1, Zhou Zhenhua2, Ren Meng1, Zhu Junfeng1

(1. Shanghai Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071, China; 2. Shuguang Hospital of Shanghai, Shanghai 201203, China)

Objective It is to observe the effect of Bushen Rougan decoction on liver tissue pathology in rats with liver fibrosis. Methods 53 SD rats were randomly divided into blank control group with 8 rats, model group with 15 rats, colchicina group with 15 rats and Bushen Rougan decoction group with 15 rats. All the rats were fed with standard rat food and given free drinking water. Except for the blank control group, the rats in the other groups were given CCl4for 8 weeks to establish liver fibrosis models. The rats in colchicina group and Bushen Rougan group were given the respective drugs by intragastric administration on the ninth week, and the rats in blank group and model group were given the same volume of normal saline intragastric administration. In 2 h after the last intragastric administration, liver tissue of the rats were gotten to do liver tissue HE, sirius red staining to evaluate the degree of liver cell degeneration of collagen fiber hyperplasia, and the expression of α-SMA in liver tissue was detected by PCR method and Western blotting. Results The degree of fibrosis of the rats in Bushen Rougan decoction group was significantly lower than that of model group. Compared with the normal group, the expression of α-SMA protein increased significantly in model group(P<0.01); compared with the rats in the model group, α-SMA protein expression in colchicine group and Bushen Rougan decoction group decreased (P<0.05). Conclusion Bushen Rougan decoction can reduce the expression level of α-SMA protein in rats with liver fibrosis and has definite effect of anti liver fibrosis.

Bushen Rougan decoction; liver fibrosis in rats; α-SMA protein

鄭亞江，女，醫(yī)學博士，副主任醫(yī)師，長期從事慢性肝病的臨床和實驗研究。

上海市衛(wèi)生局科研課題(20114058)

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.34.003

R-332

A

1008-8849(2014)34-3770-04

2014-05-20