shRNA沉默DNA-PKcs表達(dá)對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU耐藥性的影響

梁大敏，束 波，楊加偉，生 欣，范 芳

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制和病因尚不明確。DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks，DSBs)是細(xì)胞最嚴(yán)重的一種損傷，可導(dǎo)致細(xì)胞失去分裂增殖能力而死亡，是抗癌藥物致腫瘤細(xì)胞死亡主要機(jī)制。DNA依賴性蛋白激酶亞基(DNA-dependent kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)是參與非同源重組修復(fù)(nonhomologous end-joining，NHEJ)的核心組分，在NHEJ、VDJ重組和維持端粒結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用，同時(shí)可磷酸化諸多轉(zhuǎn)錄因子和修復(fù)基因[1-2]。除此之外，有研究報(bào)道DNA-PKcs與肝癌耐藥有關(guān)[3-4]。本文將shDNA-PKcs轉(zhuǎn)染肝癌耐藥細(xì)胞株BEL7402/5-FU，通過檢測(cè)DNA-PKcs沉默對(duì)細(xì)胞化療藥物敏感性的影響，初步探索shDNA-PKcs與肝癌耐藥的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 BEL7402/5-FU細(xì)胞株購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，PRNAi-U6.1-Neo shRNA質(zhì)粒購于百奧邁科生物科技有限公司，Lipofectamine?2000Reagent購于Invitrogen公司，DNA-PKcs抗體購自Assay biotech公司，P-Glycoprotein(P-gp)抗體購自abcam公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 shRNA質(zhì)粒提取與鑒定 按質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I、Hind III雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳(1.0 %瓊脂糖，120 V，30 min)，拍照。另取菌液1 mL送至百奧邁科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 BEL7402/5-FU細(xì)胞的培養(yǎng) 將BEL7402/5-FU細(xì)胞于含10 %胎牛血清、20 μg/mL 5-FU的1 640培養(yǎng)液，37 ℃、5 %CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每天換液1次，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、空質(zhì)粒組、shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組。將BEL7402/5-FU細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔種8×104個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)吸去培養(yǎng)液，將質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物加至相應(yīng)培養(yǎng)孔中，每孔200 μL，6 h后換液。48 h后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，轉(zhuǎn)染率=每個(gè)視野下的熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)/相同視野下的細(xì)胞總數(shù)×100 %。

1.2.4 Real-time PCR檢測(cè)DNA-PKcs mRNA水平的表達(dá) 細(xì)胞總RNA的提取按Trizol? Reagent試劑盒說明書進(jìn)行，Real-time PCR引物：DNA-PKcs上游5′-GTGACAAGGCAACTGTATGAGC-3，下游3′-TTCTCTAAAAACACCAGCCACA-5′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度163bp；β-actin上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3，下游3′-GGAGCGACAGGTGGAAGGTC-5′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度206bp。

各組樣品DNA-PKcs mRNA表達(dá)量經(jīng)Real-time PCR儀檢測(cè)，PCR產(chǎn)物作熔解曲線分析，根據(jù)Ct值通過公式2-(△△CT)進(jìn)行相對(duì)定量分析計(jì)算可得DNA-PKcs mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)DNA-PKcs、P-gp蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，按BCA法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品與上樣緩沖液混均，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h(RT，1 h)，孵一抗(4 ℃，過夜)，TBST洗膜3次。孵二抗(37 ℃，1 h)，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光顯色。用Quantity One定量分析軟件分析灰度比。

1.2.6 MTT法檢測(cè)藥物敏感性 取BEL7402/5-FU細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔種1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)染，6 h后棄培養(yǎng)基，分別按0、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL加入阿霉素(ADM)、絲裂霉素(MMC)、順鉑(DDP)和按0、3、6、12、24、48、96、192 μg/mL加入5-氟尿嘧啶(5-FU)。48 h后棄培養(yǎng)液，加180 μL無血清培養(yǎng)液、20 μL MTT(0.5%)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加150 μL二甲基亞砜(DMSO)，低速震蕩10 min，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(490 nm)測(cè)定各孔吸光度值。用Graphpad prism5.0計(jì)算各個(gè)藥物的IC50。

2 結(jié)果

2.1 shDNA-PKcs質(zhì)粒的鑒定 酶切電泳結(jié)果顯示：shDNA-PKcs質(zhì)粒組、陰性質(zhì)粒組約6300bp(見圖1)。shDNA-PKcs質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒插入序列如下：GATCCGGGCGCTAATCGTACTGAA TTCAAGAGATTCAGTACGATTAGCGCCCTTTTTTA。

2.2 熒光計(jì)數(shù)檢測(cè)shDNA-PKcs質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率 結(jié)果顯示：shDNA-PKcs質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約為62.2%(見圖2)。

2.3 Real time PCR檢測(cè)DNA-PKcs、P-gp mRNA水平表達(dá) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用2-△△Ct法進(jìn)行分析，結(jié)果顯示(見表1)：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、質(zhì)粒對(duì)照組DNA-PKcs、P-gp mRNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs、P-gp mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)(P<0.01)。DNA-PKcs mRNA水平的沉默效率為82.6 %。

注：1：shDNA-PKcs質(zhì)粒組；2：陰性質(zhì)粒組。圖1 酶切電泳結(jié)果

注：A:普通光源;B:熒光光源。 圖2 shDNA-PKcs質(zhì)粒細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染效率(×100)

分組DNA-PKcs mRNA水平(Ct值)P-gp mRNA水平(Ct值)β-actin mRNA水平(Ct值)DNA-PKcs相對(duì)倍數(shù)變化(2-△△Ct)P-gp相對(duì)倍數(shù)變化(2-△△Ct)空白對(duì)照組23.133±0.16423.010±0.21317.207±0.3371.000±0.0001.000±0.000脂質(zhì)體組22.493±0.13522.400±0.15816.630±0.4781.045±0.1011.026±0.095質(zhì)粒對(duì)照組22.680±0.27422.657±0.32117.047±0.6901.226±0.0521.144±0.053實(shí)驗(yàn)組26.013±0.562**24.307±0.494**17.537±0.4680.174±0.083**0.512±0.014**

注：**:與空白對(duì)照組相比P<0.01。

2.4 Western blot檢測(cè)DNA-PKcs、P-gp蛋白水平表達(dá) 結(jié)果顯示：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、質(zhì)粒對(duì)照組DNA-PKcs、P-gp表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組DNA-PKcs、P-gp蛋白表達(dá)均下降，與對(duì)照組比較差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，DNA-PKcs蛋白水平的沉默效率為71.8%(見表2，圖3)。

分組DNA-PKcs/β-actinP-gp/β-actin空白對(duì)照組1.214±0.2061.254±0.269脂質(zhì)體組1.237±0.1351.301±0.053質(zhì)粒對(duì)照組1.118±0.2121.167±0.120實(shí)驗(yàn)組0.282±0.032**0.225±0.001**

注：**:與空白對(duì)照組相比P<0.01。

2.5 MTT法檢測(cè)BEL7402/5-FU細(xì)胞的藥物敏感性 結(jié)果顯示(見表3)：空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、質(zhì)粒對(duì)照組對(duì)ADM、DDP、MMC、5FU的IC50差異

注:1：空白對(duì)照組；2：脂質(zhì)體組；3：質(zhì)粒對(duì)照組；4：shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組。 圖3 各組細(xì)胞DNA-PKcs、P-gp蛋白的表達(dá)

不明顯(P>0.05),而shDNA-PKcs實(shí)驗(yàn)組對(duì)ADM、5FU IC50降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢奃NA-PKcs的沉默可增加肝癌耐藥細(xì)胞BEL7402/5-FU對(duì)ADM、5FU的敏感性。

分組ADMDDPMMC5-FU空白對(duì)照組25.905±1.05010.539±1.3673.042±0.67386.980±4.278脂質(zhì)體組24.705±1.0259.517±3.5472.654±0.72384.070±5.742質(zhì)粒對(duì)照組23.860±2.94210.569±1.8112.718±0.50983.415±5.230實(shí)驗(yàn)組14.260±2.450*4.625±0.0211.243±0.19563.720±6.028*

注：*:與空白對(duì)照組相比P<0.05。

3 討論

肝癌是一個(gè)最常見的、致命的腫瘤。目前臨床上常采用手術(shù)聯(lián)合放化療，但長(zhǎng)期放化療后，易出現(xiàn)耐藥，這可能與DNA損傷信號(hào)失調(diào)和DNA損傷修復(fù)有關(guān)[5-6]。其中，由電離輻射或抗癌藥物如：阿霉素(拓補(bǔ)異構(gòu)酶II抑制劑)等引起的DSBs是最嚴(yán)重的損傷。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以DNA-PK為核心的非同源重組修復(fù)(non-homologous end joining，NHEJ)在DSBs修復(fù)的中發(fā)揮主要作用。

DNA -PKcs由4128個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子量為469 kD的大分子量蛋白質(zhì)，基因位于染色體8 ql1，含有一系列磷酸化位點(diǎn)以及高度保守區(qū)[7]。DSBs發(fā)生后，DNA-PKcs與Ku70/80結(jié)合到DNA末端，通過自身磷酸化和磷酸化下游蛋白如：Artemis、DNA ligase4、XRCC4和Cernunnos等完成DNA損傷修復(fù)[8]。DNA-PKcs被認(rèn)為具有腫瘤抑制功能，能維持基因組穩(wěn)定性[9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，在許多腫瘤患者經(jīng)放化療后，DNA-PKcs蛋白表達(dá)活性增加，且DNA-PKcs表達(dá)量的多少直接影響腫瘤的進(jìn)一步治療。因此，本實(shí)驗(yàn)采用RNAi技術(shù)沉默DNA-PKcs，檢測(cè)肝癌細(xì)胞對(duì)4種常用化療藥物的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默后能夠明顯增加肝癌細(xì)胞對(duì)ADM、5-FU的敏感性。目前已有一些研究表明下調(diào)DNA-PKcs能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[10-11]。然而，在耐順鉑的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者、口腔癌放療患者中已發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs活性增加[12]，表明放化療后機(jī)體產(chǎn)生了耐藥性。為了進(jìn)一步了解BEL7402/5-FU細(xì)胞耐藥的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用Real time PCR和Western blot法檢測(cè)了各組細(xì)胞的多藥耐藥蛋白P-gp mRNA和蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示DNA-PKcs沉默后P-gp mRNA和蛋白表達(dá)減少，提示DNA-PKcs的沉默可能通過下調(diào)P-gp的表達(dá)，從而增加BEL7402/5-FU細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。因此推測(cè)DNA-PKcs沉默降低細(xì)胞耐藥性的機(jī)制除了與抑制DNA損傷修復(fù)途徑有關(guān)，還可能與下調(diào)P-gp表達(dá)存在一定的聯(lián)系，具體機(jī)制還需作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。目前也有少量研究表明通過抑制DNA-PKcs下調(diào)P-gp，從而增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[3-4]。但DNA-PKcs如何調(diào)控P-gp逆轉(zhuǎn)耐藥，目前說法不一，還需要進(jìn)一步研究。

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