超敏C反應(yīng)蛋白及rs1205基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

徐福平，薛 浩

(山東省淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255036)

超敏C反應(yīng)蛋白及rs1205基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

徐福平，薛 浩

(山東省淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255036)

目的 分析并評價超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及rs1205基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性。方法 將113例中老年腦梗死患者作為觀察組，113例健康體檢者作為對照組。通過免疫透射比濁法測定hs-CRP含量；同時以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及限制性片段長度多態(tài)(RFLP)方法測定rs1205基因的多態(tài)性；采用美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評分(NIHSS)量表評定神經(jīng)功能。分析各指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果 2組的基因型頻率與等位基因的分布趨勢差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；重度患者的hs-CRP與log CRP含量均顯著高于輕、中度患者(P均<0.05)；rs1205基因型與腦梗死病情程度未見明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)。結(jié)論 hs-CRP含量與腦梗死患者病情密切相關(guān)，而rs1205基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病之間未見顯著相關(guān)性。

腦梗死;超敏C反應(yīng)蛋白；rs1205基因多態(tài)性；基因頻率

C反應(yīng)蛋白(CRP)是在機(jī)體受損、發(fā)生感染或出現(xiàn)炎癥時引起血漿濃度急劇上升的重要急性期蛋白[1]。一直以來CRP被視為重要的非特異的炎癥標(biāo)志物，但近年來的研究顯示，CRP與機(jī)體炎癥與動脈粥樣硬化等心血管疾病過程密切相關(guān)，炎癥在缺血、動脈粥樣硬化等疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示，單獨(dú)測定血清CRP含量能夠指示或預(yù)測首發(fā)與再發(fā)腦血管事件[3-5]。本研究對比觀察了老年腦梗死患者與健康體檢者的超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平及rs1205基因多態(tài)性情況，旨在評價hs-CRP及rs1205基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇2012年1月—2013年8月我院神經(jīng)內(nèi)科收治113例中老年腦梗死患者作為觀察組，均滿足全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議通過的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時經(jīng)腦CT/MRI進(jìn)一步確診。其中男79例，女34例；年齡38～91(64.3±12.1)歲；病程均≤3 d；按照美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)進(jìn)行病情分級評定：輕度(NIHSS分<6分)63例，中度(NIHSS分6～13分)39例，重度(NIHSS分>14分)11例。體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.32±6.38)kg/m2。伴有腦卒中家族史22例，伴有高血壓病史94例，伴有糖尿病史24例，伴有冠心病史31例，有吸煙史49例，有飲酒史23例。另選同期我院門診113例體檢者作為對照組，其中男69例，女44例；年齡47～82(61.9±10.4)歲；BMI(23.92±8.31)kg/m2；有腦卒中家族史1例，有高血壓病史27例，有冠心病史13例，有糖尿病史1例；有吸煙史17例，有飲酒史10例。2組均排除伴有嚴(yán)重肝腎功能不全者，腦出血、周圍血管疾病、血液病、大動脈炎、結(jié)核、重癥肺部感染、惡性腫瘤以及曾接受器官移植者。2組年齡、性別、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，存在可比性；但在常見的危險因素，包括腦卒中家族史、高血壓病史、糖尿病史、冠心病史、吸煙史以及飲酒史等，觀察組顯著高于對照組(P均<0.05)。

1.2 血清hs-CRP含量測定 全部受檢者清晨空腹(腦梗死患者在發(fā)病24 h內(nèi)，少數(shù)患者發(fā)病在3 d內(nèi))抽取2 mL靜脈血，使用荷蘭Vital全自動生化分析儀進(jìn)行分析，通過免疫透射比濁法測定hs-CRP含量。

1.3 CRP基因型分析 抽取5 mL肘靜脈血，選擇低滲溶血及酚氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，TE緩沖液溶解保存；通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析rs1205基因多態(tài)性，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列：上游引物為5’-TCGAGGTTCCTGAAGTCACA-3’，下游引物為5’-AACAAAGGCCCAGAGACAGA-3’，內(nèi)切酶CC型為149 bp和128 bp，CT型為275 bp，149 bp，128 bp，TT型為275 bp和128 bp。25 μL的反應(yīng)體系包括:10×PCR緩沖液2.5 μL，1 μL 25 mmol/L Mg2+，25 nmol/L 4×dNTP 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，1 μL基因組DNA模板，0.5 μL Taq DNA聚合酶5 IU/μL，2.5 μL二甲基亞砜。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸55 s，共22個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存待用。限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系總體積20 μL包括：10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2 μL 10×Buffer，2 IU內(nèi)切酶，在37 ℃條件下酶切14 h。將pUC19DNA/MspI酶解片段作為DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)物，配置濃度為20%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，結(jié)果見圖1。

圖1 rs 1205基因酶切片段20%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 2組基因型結(jié)果對比 在全部受檢者中，rs1205基因型的頻率依次為CC型占12.7%，CT型占48.7%，TT型占34.1%；等位基因C頻率為0.416，等位基因T頻率為0.584，符合Hardy-Weinberg平衡(2=0.017，P=0.891)。2組受檢者的基因型頻率與等位基因的分布趨勢差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 2組rs 1205基因型及等位基因頻率比較 例(%)

2.2 不同CRP基因型患者h(yuǎn)s-CRP含量情況 rs1205的CC、CT、TT 3種基因型log CRP含量為(0.355±0.599)lg mg/L、(0.249±0.601)lg mg/L及(0.168±0.641)lg mg/L，三者基因型的血清lg CRP含量依次遞降，但三者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 觀察組不同病情患者CRP含量比較 觀察組重度患者的hs-CRP與lg CRP含量均顯著高于輕、中度患者(P均<0.05)。見表2。

表2 不同病情腦梗死患者h(yuǎn)s-CRP含量比較±s)

注：①與重度比較，P<0.05。

表3 hs-CRP基因型與腦梗死病情關(guān)系 例

3 討 論

目前已證實(shí)動脈粥樣硬化是腦梗死的基本病因，而且腦梗死是一個慢性炎性過程[6]。Nozue等[7]的研究顯示，性別、年齡及體質(zhì)量等指標(biāo)能夠影響血清CRP含量。CRP能夠激活補(bǔ)體同時增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的吞噬能力進(jìn)而發(fā)揮調(diào)理功能，有效清除入侵機(jī)體的病原菌，修復(fù)并清理損傷、壞死以及程序化死亡的組織細(xì)胞，在天然免疫過程中起保護(hù)作用。CRP已被認(rèn)為是心血管疾病最敏感的預(yù)示因子或危險因子[8]。rs1205單核苷酸多態(tài)性(SNP)是CRP最為常見的多態(tài)性之一，其位于CRP基因的3’端非翻譯區(qū)[9]。不同研究機(jī)構(gòu)關(guān)于rs1205影響hs-CRP含量的研究結(jié)果各不相同[10]。本研究結(jié)果顯示帶有rs1205T等位基因的受檢者血清hs-CRP含量低，但與CRP含量之間無明顯的相關(guān)性，分析這可能是由于CRP的含量變化由諸多因素決定的，而且遺傳方面的影響不大[11]。不同種族、不同地區(qū)人群的rs1205的分布各不相同[12]。通過對NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫查詢顯示，歐洲人rs1205T等位基因頻率為0.33，而非洲人rs1205T等位基因頻率為0.15；黃種人(北京地區(qū))則為0.56。在本研究中，rs1205T單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)共有CC、CT及TT 3種基因型,其中等位基因T的頻率為0.584[13-14]。本研究所得等位基因T的分布頻率顯著高于歐洲人，且與中國北京黃種人的分布頻率基本相似[15]。這表明T等位基因頻率在不同人種的分布是不同的。CRP含量與缺血性腦梗死的發(fā)病密切相關(guān), 而關(guān)于CRP基因多態(tài)性與缺血性腦梗死的相關(guān)性卻并無定論[16-18]。Di Napoli等[19]分析了4個人類CRP 基因單核苷酸多態(tài)性基因型rs1341662，rs1130864，rs1800947以及rs1205后發(fā)現(xiàn)，僅rs1800947與缺血性腦梗死有明顯的相關(guān)性。Tanno等[20]對4個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs1205，rs3093075，rs1800947以及rs1130864)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示無相關(guān)的SNP位點(diǎn)或SNP單體型與缺血性腦梗死具有關(guān)聯(lián)，但3個SNP位點(diǎn)(rs1130864、rs1800947以及rs3093075)與微血管閉室密切相關(guān)。Park等[21]的研究亦未見rs1205與缺血性腦梗死具有相關(guān)性，但單體型H3與缺血性腦梗死密切相關(guān)。本研究未對腦梗死類型進(jìn)行細(xì)致劃分及構(gòu)建單體型，結(jié)果顯示重度腦梗死患者的hs-CRP含量明顯高于輕度與中度患者，rs1205基因型與腦梗死及腦梗死病情的嚴(yán)重程度均無明顯相關(guān)性，與以往報(bào)道的結(jié)果相符?？傊狙芯拷Y(jié)果顯示hs-CRP含量與腦梗死患者病情密切相關(guān)，rs1205基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病之間未見明顯相關(guān)性。

[1] Tu WJ,Zhao SJ,Liu TG,et al. Combination of high-sensitivity C-reactive protein and homocysteine predicts the short-term outcomes of Chinese patients with acute ischemic stroke[J]. Neurol Res，2013,35(9):912-921

[2] Arikanoglu A,Yucel Y,Acar A,et al. The relationship of the mean platelet volume and C-reactive protein levels with mortality in ischemic stroke patients[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013,17(13):1774-1777

[3] Ahmadi-Abhari S,Luben RN,Wareham NJ,et al. Seventeen year risk of all-cause and cause-specific mortality associated with C-reactive protein,fibrinogen and leukocyte count in men and women:the EPIC-Norfolk study[J]. Eur J Epidemiol，2013,28(7):541-550

[4] 鄧可,肖志杰,趙水平,等. 血清超敏C-反應(yīng)蛋白水平及CRP 1059G/C基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性[J]. 臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2009，22(6): 413-415

[5] 錢鐵鏞. 高敏C反應(yīng)蛋白、脂聯(lián)素、同型半胱氨酸與2型糖尿病大血管病變的相關(guān)性研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2010,19(4):403-404

[6] Abubakar SA,Okubadejo NU,Ojo OO,et al. Relationship between admission serum C-reactive protein and short term outcome following acute ischaemic stroke at a tertiary health institution in Nigeria[J]. Niger J Clin Pract，2013,16(3):320-324

[7] Nozue T,Fukui K,Yamamoto S,et al. C-Reactive protein and future cardiovascular events in statin-treated patients with angina pectoris:the extended TRUTH study[J]. J Atheroscler Thromb，2013,20(9):717-725

[8] Dahan E,Dichtwald S,Amar E,et al. Low plasma C-reactive protein level as an early diagnostic tool for heatstroke vs central nervous system-associated infection in the ED[J]. Am J Emerg Med，2013,31(8):1176-1180

[9] Oda E. High-sensitivity C-reactive protein and white blood cell c-ount equally predict development of the metabolic syndrome in a Japanese health screening population[J]. Acta Diabetol，2013,50(4):633-638

[10] Rallidis LS,Tellis CC,Lekakis J,et al. Lipoprotein-associated phospholipase A(2) bound on high-density lipoprotein is associated with lower risk for cardiac death in stable coronary artery disease patients:a 3-year follow-up[J]. J Am Coll Cardiol，2012,60(20):2053-2060

[11] Kral M,Skoloudik D,Sanak D,et al. Assessment of relationship between acute ischemic stroke and heart disease-protocol of a prospective observational trial[J]. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2012,156(3):284-289

[12] Tang WH,Hartiala J,Fan Y,et al. Clinical and genetic association of serum paraoxonase and arylesterase activities with cardiovascular risk[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012,32(11):2803-2812

[13] Elliott P,Chambers JC,Zhang W,et al. Genetic loci associated with C-reactive protein levels and risk of coronary heart disease[J]. JAMA,2009,302(1):37-48

[14] Crawford DC,Sanders CL,Qin X,et al. Genetic variation is associated with C-reactive protein levels in the Third National Health and Nutrition Examination Survey[J]. Circulation,2006，114(23):2458-2465

[15] Shen C,Sun X,Wang H,et al. Association study of CRP gene and ischemic stroke in a Chinese Han population[J]. J Mol Neurosci，2013,49(3):559-566

[17] Tsai NW,Lee LH,Huang CR,et al. The association of statin therapy and high-sensitivity C-reactive protein level for predicting clinical outcome in acute non-cardioembolic ischemic stroke[J]. Clin Chim Acta，2012,413(23/24):1861-1865

[18] Leonards CO,Ipsen N,Malzahn U,et al. White matter lesion severity in mild acute ischemic stroke patients and functional outcome after 1 year[J]. Stroke，2012,43(11):3046-3051

[19] Di Napoli M,Godoy DA,Campi V,et al. C-reactive protein in intracerebral hemorrhage:time course, tissue localization, and prognosis[J]. Neurology，2012,79(7):690-699[20] Tanno K,Ohsawa M,Onoda T,et al. Poor self-rated health is significantly associated with elevated C-reactive protein levels in women,but not in men,in the Japanese general population[J]. J Psychosom Res，2012,73(3):225-231

[21] Park HE,Cho GY,Chun EJ,et al. Can C-reactive protein predict cardiovascular events in asymptomatic patients Analysis based on plaque characterization[J]. Atherosclerosis，2012,224(1):201-207

The relevance study of hyper-sensitive C-reactive protein genes & rs1205 gene polymorphism and cerebral infarction

Xu Fuping，Xue Hao

(The Center Hospital of Zibo，Zibo 255036,Shandong China)

Objective: It is to analyze and evaluate the relevance of hyper-sensitive C-reactive protein(hs-CRP) & rs1205 gene polymorphism and cerebral infarction.Methods 113 patients with elderly cerebral infarction were selected as observation group, and 113 healthy controls were used as control group.The content of hs-CRP levels was determined by immune transmission turbidimetry; At the same time,rs1205 gene polymorphism was examined by polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) methods;Nerve function was evaluated by neurological deficit score of the National Institutes of Health of USA. The relationships among every indexes were analyzed. Results Genotype frequency and the distribution trend of alleles of the patients with cerebral infarction of observation group and the subjects of control group were the same, the differences were not significant(P>0.05);hs-CRP and log CRP levels of severe patients were significantly higher than those of mild and moderate patients(P<0.05);There was no obvious correlation between rs1205 gene type and cerebral infarction disease degree. Conclusion The content of hs-CRP is closely related with states of patients with brain infarction, while rs1205 gene polymorphism had no significant relationship with the occurrence of cerebral infarction.

cerebral infarction;hyper-sensitive C-reactive protein genes; gene polymorphism;gene frequency

徐福平，女，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.35.007

R743.3

A

1008-8849(2014)35-3898-04

2014-06-01