甘肅省18種藥用植物病毒病調(diào)查及2種病毒病的鑒定

劉 雯， 晏立英， 文朝慧， 陳秀蓉*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 蘭州 730070; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所,武漢 430062;3.甘肅出入境檢驗檢疫局, 蘭州 730010)

調(diào)查研究

甘肅省18種藥用植物病毒病調(diào)查及2種病毒病的鑒定

劉 雯1， 晏立英2， 文朝慧3， 陳秀蓉1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室,甘肅省草業(yè)工程實驗室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 蘭州 730070; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所,武漢 430062;3.甘肅出入境檢驗檢疫局, 蘭州 730010)

2012年6月至2013年9月對甘肅省宕昌縣、漳縣、岷縣、渭源縣、隴西縣、臨洮縣等地區(qū)種植的具有疑似病毒病癥狀的半夏等18種藥用植物進(jìn)行調(diào)查及采樣。采用黃瓜花葉病毒(CMV)、苜?；ㄈ~病毒(AMV)、煙草花葉病毒(TMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、蕪菁花葉病毒(TuMV)等7種雙抗體夾心免疫酶聯(lián)檢測(DAS-ELISA)試劑盒初檢,并對CMV和ToMV采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法復(fù)檢,結(jié)果表明,半夏、掌葉大黃和紅花3種藥用植物受到黃瓜花葉病毒(CMV)侵染；馬兜鈴、土貝母及當(dāng)歸3種植物受到番茄花葉病毒(ToMV)侵染；樣品中未檢測到上述其他病毒種類,其余12種病毒樣品的病原尚未確定。本研究為國內(nèi)首次報道CMV病毒侵染掌葉大黃、紅花,ToMV病毒侵染馬兜鈴、當(dāng)歸和土貝母。此研究為防治上述病毒病提供了依據(jù)。

藥用植物; 病毒病; DAS-ELISA; RT-PCR

甘肅省是全國重要的藥材生產(chǎn)大省之一,2009年中藥材種植面積達(dá)到全國的三分之一[1]。甘肅省中藥材種植分布廣、種類多、產(chǎn)量大,豐富了甘肅的農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu),是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)收入的又一來源,在許多地區(qū)已成為當(dāng)?shù)氐闹еa(chǎn)業(yè)[2]。但隨著種植面積的擴(kuò)大,病害連年發(fā)生,日趨嚴(yán)重。甘肅省關(guān)于中藥材病害的研究,主要集中在真菌病害上,中藥材病毒病鮮見報道。目前國內(nèi)文獻(xiàn)報道了侵染半夏、當(dāng)歸及地黃3種植物的病毒種類,侵染半夏的病毒有芋花葉病毒(Dasheenmosaicvirus, DMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)和大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus, SMV)[3-4]；侵染當(dāng)歸的病毒有馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)[5]；侵染地黃的病毒有煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、地黃退化病毒(Dihuangdegenerationvirus, DDV)、蠶豆萎蔫病毒(Broadbeanwiltvirus, BBWV)[6-7]等。

關(guān)于植物病毒病毒源的檢測鑒定,目前主要有生物學(xué)方法、電鏡法、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。其中血清學(xué)方法具有特異性好、操作簡便、檢測周期短的特點,但在準(zhǔn)確性和靈敏度方面還有一定的缺陷；分子生物學(xué)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點,能夠彌補(bǔ)血清學(xué)方法的缺點[8]。國內(nèi)外文獻(xiàn)關(guān)于植物病毒的檢測主要采用血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的辦法,其中雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)是使用最多的方法[9-10]。

本研究對甘肅省宕昌縣、漳縣、岷縣、隴西縣、渭源縣和臨洮縣6縣種植的黨參、栝樓、紅花及藿香等18種藥用植物上疑似病毒病癥狀樣品進(jìn)行了調(diào)查和采樣,并通過DAS-ELISA及RT-PCR進(jìn)行檢測鑒定,確定其病毒種類,旨在為甘肅省藥用植物病毒病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集時間及地點

2012年7月至2013年9月對甘肅宕昌縣阿塢鄉(xiāng)、哈達(dá)鋪鎮(zhèn)、官鵝溝藥材園,漳縣大草灘,岷縣麻子川,渭源縣會川鎮(zhèn),隴西首陽藥材示范園,臨洮縣玉井鎮(zhèn)、南河鄉(xiāng)等地的疑似病毒病癥狀的半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Breit]、土貝母(Cyanotisvaga(Lour.)Roem.)、當(dāng)歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]、黨參[Codonopsispilosula(Franch)Nannf.]、地黃[Rehmanniaglutinosa(Gaert.)Libosch.exFisch.etMey.]、栝樓(Trichosanthessp.)、紅花(CarthamustinctoriusLinn.)、藿香[Agastacherugosa(Fisch.etMey.)O.Kuntze]、馬兜鈴(AristolochiadebilisSieb.etZucc)、射干[Belamcandachinensis(Linn.)DC.]、玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)、天仙子(HyoscyamusnigerLinn.)、刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms]、芍藥(PaeonialactifloraPall.)、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、款冬花(TussilagofarfaraLinn.)、山藥(DioscoreaoppositaThunb.)、掌葉大黃(RheumpalmatumLinn.)共18種藥用植物進(jìn)行采集、癥狀描述并拍照,采集的樣品置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?通過檢測確定這些植物是否含有病毒,并確定病毒的種類。

1.1.2 試劑

DAS-ELISA檢測試劑盒及陽性對照購自美國Agdia公司,檢測的病毒種類包括黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、苜蓿花葉病毒(Alfalfamosaicvirus, AMV)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus, ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX, PVX)和蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus, TuMV)等7種。

植物總RNA 提取試劑盒購自天根公司；One step RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司,其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

分別稱取不同癥狀的藥用植物的葉片3.0 g,加入3倍體積的PBST緩沖液,充分研磨后裝入離心管中,然后3 000 r/min離心5 min,上清液用于DAS-ELISA檢測,另取300 μL上清液按照RNA提取試劑盒說明提取植物總RNA。

1.2.2 血清學(xué)檢測

采用DAS-ELISA方法,按照試劑盒說明書,對植物提取液進(jìn)行檢測,每個樣品設(shè)計兩孔重復(fù),并設(shè)計陰性和陽性對照,每孔加入100 μL待測樣品,顯色后用芬蘭雷柏酶標(biāo)儀在405 nm波長下測吸光值。當(dāng)樣品吸光值與陰性對照吸光值的比值≥2時,判定結(jié)果為陽性。

1.2.3 RT-PCR檢測

1.2.3.1引物設(shè)計

參照已發(fā)表的文獻(xiàn)中[11-12]報道的CMV、ToMV CP基因的特異引物序列合成引物CMVF:5′-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3′,CMVR:5′-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3′;ToMVF:5′-CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG-3′,ToMVR:5′-ATTAAGGGAAAAVCACT-3′用于檢測CMV、ToMV的CP基因片段。

1.2.3.2RT-PCR擴(kuò)增

以植物總RNA為模板按照TaKaRa One Step RT-PCR 反應(yīng)試劑盒說明書配制25 μL反應(yīng)體系：2×Step Buffer 12.5 μL,Enzyme Mix 1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL, RNase Free H2O 8 μL,植物總RNA模板1.5 μL。CMV RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min; 94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s, 55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存；ToMV RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min; 94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s, 54 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物,含有目的條帶的RT-PCR產(chǎn)物送金唯智生物公司測序。

1.2.3.3序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將獲得的CMV和ToMV序列與NCBI上同源序列進(jìn)行BALST比對后,下載同源序列,用Clustal(Version 1.81)進(jìn)行多重序列匹配排列(multiple alignments)分析,形成一個多序列匹配排列陣,然后用Mega(Version 5.0) 通過鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥用植物病毒病的癥狀

對采集的18種藥用植物的疑似病毒病樣品進(jìn)行檢測,其中有6種植物檢測到病毒,其相應(yīng)癥狀及發(fā)生危害情況描述如下。

半夏病毒?。喊l(fā)病初期葉脈顏色正常,葉肉組織變?yōu)辄S色,褪綠不均勻,主要表現(xiàn)綠斑駁花葉,葉片邊緣向上卷曲；有些葉片葉緣出現(xiàn)鋸齒狀；有些葉片基部皺縮、畸形及全株矮縮、死亡；有些產(chǎn)生黃色條斑及明脈,見圖1a～b。此病發(fā)生危害重,在各地種植區(qū)普遍發(fā)生,許多田塊幾乎全田發(fā)病,是目前半夏生產(chǎn)中危害最重的病害。

土貝母病毒?。喊l(fā)病初期在葉片上出現(xiàn)隱約可見的輕微花葉,葉脈透明,出現(xiàn)明脈,后期葉片綠色出現(xiàn)明顯可見的皰斑花葉；有些葉片有黃色環(huán)斑,見圖1c。此病在調(diào)查的土貝母田均有發(fā)生,危害較重,是土貝母的主要病害之一。

圖1 幾種中草藥病毒病的癥狀

當(dāng)歸病毒?。喊l(fā)病初期,僅上部葉片出現(xiàn)隱約可見的輕微花葉,逐漸出現(xiàn)黃綠不規(guī)則的皰斑花葉,葉片略變硬變脆；有少數(shù)葉片表現(xiàn)蕨葉,見圖1d。此病在調(diào)查區(qū)域均有發(fā)生,但危害較輕。

紅花病毒?。喊l(fā)病后幼葉皺縮明顯,葉片仍為綠色,老葉出現(xiàn)黃化,逐漸由葉尖向葉基部黃化,老葉皺縮不明顯,見圖1e。此病在紅花田發(fā)生較輕。

掌葉大黃病毒病：在葉片上出現(xiàn)明脈,幼葉皺縮明顯,出現(xiàn)黃綠不均勻的花葉,老葉葉肉組織濃綠,但在靠葉脈處有輕微褪綠現(xiàn)象,后發(fā)展為皰斑花葉。有少數(shù)葉片上有環(huán)斑。發(fā)病嚴(yán)重時,葉片畸形,見圖1f～g。在掌葉大黃上發(fā)生較輕。

馬兜鈴病毒?。翰≈耆~片一般稍小,葉片感病后有些出現(xiàn)葉肉組織黃化、淺綠和深綠不規(guī)則的花葉；有些葉片出現(xiàn)黃綠皰斑和明脈見圖1h～j。是馬兜鈴上的常見病害,但危害較輕。

2.2 血清學(xué)測試結(jié)果

DAS-ELISA檢測結(jié)果表明,18種中藥材植物中紅花樣品的CMV檢測值與陰性對照的比值大于2,呈現(xiàn)陽性；馬兜鈴、當(dāng)歸及土貝母的ToMV檢測值與陰性對照的比值大于2,呈陽性(表1)。18種中草藥的TuMV、AMV、PVY、PVX、TMV的檢測值與陰性值比均小于2,檢測結(jié)果為陰性。初步確定紅花攜帶有CMV病毒,馬兜鈴、當(dāng)歸、土貝母攜帶有ToMV病毒。

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果

2.3.1 電泳檢測結(jié)果

根據(jù)上述檢測結(jié)果,進(jìn)一步采用RT-PCR檢測18種藥用植物中是否含有CMV和ToMV。電泳檢測結(jié)果可看出,半夏、掌葉大黃和紅花3種植物在776 bp處出現(xiàn)了與CMV陽性對照大小一致的條帶,檢測結(jié)果呈陽性(圖2a)；馬兜鈴、土貝母及當(dāng)歸均在686 bp處出現(xiàn)了與ToMV陽性對照大小一致的條帶,檢測結(jié)果為陽性(圖2b)；其他中草藥均未檢測出任何條帶。

表1中草藥CMV及ToMV的DAS-ELISA檢測結(jié)果

Table1DAS-ELISAdetectionofCMVandToMVonmedicalherbs

樣品SampleCMV檢測值A(chǔ)405A405反應(yīng)類型ReactiontypeToMV檢測值A(chǔ)405A405反應(yīng)類型Reactiontype陽性對照Positivecontrol0．210+0．958+陰性對照Negativecontrol0．087-0．081-半夏Pinelliaternata0．102-0．076-掌葉大黃Rheumpalmatum0．085-0．076-紅花Carthamustinctorius1．639+0．096-馬兜鈴Aristolochiadebilis0．090-0．218+當(dāng)歸Angelicasinensis0．106-0．182+土貝母Cyanotisvaga0．100-0．182+

1) +: 陽性反應(yīng); -: 陰性反應(yīng) +: Positive; -: Negative

圖2 幾種中草藥的RT-PCR檢測

2.3.2 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

ELISA和RT-PCR檢測結(jié)果表明半夏、掌葉大黃、紅花攜帶有CMV病毒,馬兜鈴、土貝母、當(dāng)歸攜帶有ToMV病毒,選取具有代表性的植物紅花、馬兜鈴進(jìn)一步測序和BLAST分析,結(jié)果表明,紅花上CMV(CMV-HH-1分離物)序列(登錄號JX878884.1)與已報道的CMV序列(登錄號Z12818.1,tobacco,M21464.1,cucumber,U22822.1)同源性達(dá)98%,選取NCBI登陸的CMV CP基因氨基酸序列,進(jìn)一步用Clustal(Version 1.81)和Mega(Version 5.0)通過鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果(圖3)可以看出,CMV-HH-1是CMV亞族Ⅱ株系。從分子水平上進(jìn)一步確定半夏、掌葉大黃及紅花植物上攜帶有CMV病毒。馬兜鈴上ToMV長度為686 bp,經(jīng)BLAST分析,與已報道的ToMV序列(登錄號DQ873692.1,tomato,AB355139.1,tobacco,AJ429085.1,Lycopersiconperuvianum)同源性達(dá)98%,選取NCBI登錄的ToMV煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、煙草輕綠花葉病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)CP基因氨基酸序列,進(jìn)一步用Clustal(Version 1.81)和Mega(Version 5.0)通過鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果(圖4)可以看出,該病毒(MDL分離物)是ToMV株系。從分子水平上進(jìn)一步確定,馬兜鈴上攜帶有ToMV病毒。

圖3 紅花CMV-HH-1分離物與部分CMV分離物CP基因氨基酸序列同源性分析

3 討論

通過DAS-ELISA方法檢測到紅花含有CMV病毒,馬兜鈴、當(dāng)歸、土貝母含有ToMV,與RT-PCR方法檢測結(jié)果一致；用DAS-ELISA方法對半夏、掌葉大黃樣品進(jìn)行CMV病毒檢測的結(jié)果為陰性,但通過RT-PCR方法在該樣品中檢測到CMV,可能是由于半夏、掌葉大黃樣品中病毒含量較低,受DAS-ELISA靈敏度限制所致。這與郭巧萍[13]報道的DAS-ELISA方法靈敏度不夠高,不能完全檢測出半夏上的CMV病毒的結(jié)果相一致。相比之下,RT-PCR方法的檢測靈敏度更高、特異性更強(qiáng)[14-15],本研究利用RT-PCR在核酸水平上證明了病毒的存在。

圖4 馬兜鈴MDL分離物與部分ToMV分離物CP基因氨基酸序列同源性分析

利用已購買的7種病毒檢測試劑盒對18種中草藥進(jìn)行檢測,初步檢測到6種藥用植物上攜帶的病毒,剩下12種未檢測到病毒,還需要后期繼續(xù)其他種類病毒的檢測鑒定。本研究中掌葉大黃、紅花上檢測到CMV病毒,馬兜鈴、當(dāng)歸、土貝母上檢測到ToMV病毒尚屬國內(nèi)首次報道。其中當(dāng)歸受ToMV侵染后主要表現(xiàn)出花葉和蕨葉的癥狀，除張玉[2]報道的當(dāng)歸受PVY侵染后葉片呈現(xiàn)斑點的癥狀以外，未見其他關(guān)于當(dāng)歸病毒病及癥狀的報道。建議后期工作對上述幾種植物中的病毒進(jìn)行電鏡觀察、生物學(xué)接種等深入系統(tǒng)的研究。

本研究初步檢測出甘肅地區(qū)中草藥病毒病的病毒種類主要有CMV和ToMV。CMV、ToMV為常見植物病毒,發(fā)生普遍、寄主范圍廣,經(jīng)濟(jì)危害嚴(yán)重；其中CMV能侵染85科1 000多種單、雙子葉植物,能夠通過種子、繁殖材料和蚜蟲傳播[16]；ToMV能侵染茄科、十字花科等許多科植物,能夠通過種子、機(jī)械損傷和蚜蟲傳播[17]。其他5種病毒未檢測到,其原因是由于未被這5種病毒侵染,還是由于采集的標(biāo)本數(shù)量有限,有待進(jìn)一步研究。由于甘肅省藥用植物種植面積大,種植地區(qū)比較固定,種植時間久,繁殖方法多以無性繁殖為主,致使病毒病的發(fā)生較重,如果不及時進(jìn)行控制,病毒病會逐年加重造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。繁殖無毒種苗、加強(qiáng)田間管理、使用防蟲網(wǎng)防止蚜蟲等害蟲、不與其他作物混種等措施可有效防止病毒病的發(fā)生。本研究初步對甘肅地區(qū)中草藥病毒病的種類進(jìn)行了確定,對病害防治和脫毒苗生產(chǎn)提供了重要依據(jù)。

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Surveyofvirusdiseaseson18speciesofmedicalherbsinGansuProvinceandidentificationoftwovirusdisease

Liu Wen1, Yan Liying2, Wen Zhaohui3, Chen Xiurong1

(1.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,PrataculturalCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.OilCropsResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430062,China;3.GansuExit-EntryInspectionandQuarantineBureau,Lanzhou730010,China)

Eighteen species of medical herbs showing virus-like symptoms were surveyed for the occurrence of viruses in Gansu Province.Cucumbermosaicvirus(CMV),Alfalfamosaicvirus(AMV),Tobaccomosaicvirus(TMV),Tomatomosaicvirus(ToMV),PotatovirusY (PVY),PotatovirusX (PVX), andTurnipmosaicvirus(TuMV) were detected in leaf samples by DAS-ELISA. The ELISA results showed that CMV was onPinelliaternata,RheumpalmatumandCarthamustinctoriusand ToMV was onAristolochiadebilis,BolbostemmapaniculatumandAngelicasinensis. Their presence was confirmed by RT-PCR with amplification of 776 bp and 686 bp fragments of the coat protein genes, respectively. Sequence analysis of viral amplicons demonstrated Gansu isolates had high (98%) nucleotide sequence identities with other CMV and ToMV strains. It is the first report of CMV infectingR.palmatumandC.tinctoriusand ToMV infectingA.debilis,B.paniculatum, andA.sinensisin China.

medical herbs; plant virus disease; DAS-ELISA; RT-PCR

2013-10-31

：2014-02-12

甘肅省中藥材產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)項目(GYC11-01)；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2012IK270);甘肅出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(2011GK001)

S 435.67

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.025

* 通信作者 E-mail: chenxiurong@gsau.edu.cn