加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腫瘤化療所致小鼠免疫功能低下的影響

黃朝忠，劉 智，蘇 穎，胡亞男

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117)

目前絕大多數(shù)腫瘤患者依然采用術(shù)后放化療治療，但是放化療在取得臨床療效的同時(shí)其毒副作用越來越嚴(yán)重的影響術(shù)后的整體治療與康復(fù)，尤其是對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞，因此，在臨床當(dāng)中采取有效的預(yù)防治療措施降低其毒副作用顯得尤為重要，引起人們的廣泛關(guān)注[1]。隨著中醫(yī)藥在臨床治療腫瘤過程中的嘗試與運(yùn)用，尤其是在提高放化療患者免疫力方面，已經(jīng)受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重視[2]。本研究從臨床實(shí)際出發(fā)，采用氣血相生的加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯，通過對(duì)小鼠外周血、淋巴細(xì)胞增殖程度、G-CSF活性的檢測(cè)，觀察加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)經(jīng)環(huán)磷酰胺(CY)抑制的免疫功能低下荷瘤小鼠所具有的免疫功能重建作用，證明中醫(yī)藥可正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，并為篩選出最佳的治療劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用昆明種小鼠，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄各半，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格編號(hào)為SCXX(吉)-2011-0004。加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯根據(jù)藥典調(diào)配，按湯劑常規(guī)煎藥2次后混合藥液,濃縮成浸膏冰箱備用。中藥飲片由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。環(huán)磷酰胺：每支200 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)04090321。G-CSF試劑盒為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 60只清潔型昆明小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、腫瘤組、環(huán)磷酰胺干預(yù)治療模型組、加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低劑量治療組，每組10只，雌雄各半。動(dòng)物室室溫在18～21 ℃,相對(duì)濕度在40%～60%，光照每日12 h，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合GB 1495-94國家標(biāo)準(zhǔn)。除空白對(duì)照組外其余各組進(jìn)行H22肝癌腹水瘤的接種。加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯給藥第8天開始對(duì)模型組、加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中、低治療組進(jìn)行小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg[3]，隔日注射。中藥灌服組小鼠按劑量分別灌胃給藥，給藥劑量按照小鼠臨床等效計(jì)算所得，空白組、腫瘤組與模型組同時(shí)灌服生理鹽水，連續(xù)14 d，給藥組按體積為30 mL/kg體質(zhì)量，1次/d灌服。中藥灌服第8天開始空白對(duì)照組和腫瘤組小鼠注射等體積的生理鹽水，其余各組小鼠按80 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，隔日注射1次，共注射3次。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 小鼠RBC、WBC、Hb水平的測(cè)定：將昆明小鼠于第14天末次給藥20 h后小鼠眼球取血，加入EDTA-Na2抗凝劑抗凝，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定計(jì)數(shù)情況。

1.4 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的測(cè)定 將昆明小鼠眼球取血，置于2 500 r/min離心機(jī)上，離心40 min后分離血清，放置-25 ℃冰箱保存,用ELISA法檢測(cè)小鼠外周血G-CSF活性。

1.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 末次給藥20 h后眼球取血脫頸處死,置于75%乙醇溶液中浸泡，無菌條件下取小鼠脾臟研磨,以3 mL Hank's液將脾細(xì)胞沖入無菌平皿中，覆蓋16層紗布于細(xì)胞懸液上，過濾吸出細(xì)胞懸液離心洗滌1 000 r/min 15min，棄掉上清液加入3 mL完全1640營養(yǎng)液，調(diào)整脾細(xì)胞懸液1×106個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液100 μL/mL加入96孔板并加入濃度為10 μg/mL的ConA 100 μL/mL(終濃度為5 mg/mL)同時(shí)設(shè)置ConA對(duì)照孔及空白對(duì)照孔，平行3復(fù)孔。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育68 h，培養(yǎng)終止前4 h每孔加入濃度為5 mg/mL MTT 10 μL繼續(xù)37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后800 r/min離心10 min棄上清液150 μL，每孔加入有機(jī)溶劑甲基亞砜(DMSO)100 μL及甘氨酸緩沖液20 μL，570 nm處酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)荷瘤小鼠紅、白細(xì)胞水平及血紅蛋白水平的影響 見表1。

表1 治療后各組紅、白細(xì)胞和血紅蛋白水平的表達(dá)

注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01；與腫瘤組比較，△△P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表1可知,腫瘤組與空白對(duì)照組相比較紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白水平降低(P<0.01)，表明荷瘤小鼠癌細(xì)胞接種成功。與腫瘤組相比較環(huán)磷酰胺干預(yù)治療模型鼠的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白水平顯著下降(P<0.01)，提示環(huán)磷酰胺造模成功。與模型組相比較，加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯聯(lián)合CY治療的小鼠紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白水平升高(P<0.05)，尤以加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組的白細(xì)胞水平顯著的升高(P<0.01)，由此說明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯可使荷瘤小鼠CY化療后紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白水平回升，尤以中劑量效果最佳。

2.2 對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(MTT法) 見表2。

表2 治療后各組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的表達(dá)

注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01；與腫瘤組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表2可知，腫瘤組與空白組相比較P<0.01,提示荷瘤接種成功。模型組與腫瘤組相比較P<0.01，證明環(huán)磷酰胺干預(yù)治療造模成功。加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組與模型組相比較P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中、低劑量與模型組相比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、低劑量可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。

2.3 對(duì)小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子的影響 見表3。

組 別數(shù)值空白對(duì)照組 16.406 6±0.562 65 腫瘤組 13.079 0±0.330 81##腫瘤CY組(模型組) 9.953 0±0.623 47△△高劑量治療組 19.005 4±0.536 41▲ 中劑量治療組 17.966 9±0.477 52▲▲低劑量治療組 15.960 9±0.489 88▲

注：與空白對(duì)照組比較，##P<0.01；與腫瘤組比較，△△P<0.01；與模型組相比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

由表3可知，腫瘤組與空白組相比較P<0.01,得知荷瘤接種成功。模型組與腫瘤組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，得知環(huán)磷酰胺干預(yù)治療模型成功。加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯的高、中、低劑量治療組與模型組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,P<0.05)，說明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)小鼠的G-SCF活性具有明顯的刺激回升，3組之間相比較得知中劑量效果最好，證明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠提高荷瘤小鼠經(jīng)環(huán)磷酰胺化療后的G-SCF活性，增強(qiáng)免疫力。

3 討論

環(huán)磷酰胺(CY)是目前臨床上廣泛運(yùn)用于治療惡性腫瘤的烷化劑抗腫瘤藥物，由于CY屬于非特異性的烷化劑[3]，對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞無選擇性的都具有殺滅的能力,因此在取得療效的同時(shí)不可避免的帶來了毒副作用，對(duì)全身多種組織器官造成殺傷尤以骨髓抑制更為明顯。其中G-CSF水平下降可能是由于CY化療后對(duì)機(jī)體的損傷造成的，G-CSF活性的降低可能與白細(xì)胞減少和骨髓抑制有關(guān)[4]。近年來,實(shí)驗(yàn)表明G-CSF對(duì)腫瘤化療后引起的白細(xì)胞減少具有預(yù)防的作用,能夠很大程度上改善化療后白細(xì)胞下降的幅度[5]。

近年來紅細(xì)胞與白細(xì)胞一樣在免疫學(xué)研究方面已經(jīng)成為不可忽視的免疫細(xì)胞，紅細(xì)胞不僅具有識(shí)別、殺傷抗原與清除免疫復(fù)合物的作用而且還參與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[6]。因此本研究采用荷瘤小鼠為研究對(duì)象,選用環(huán)磷酰胺干預(yù)治療為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停∈蟮腞BC、WBC、Hb水平和G-CSF活性指標(biāo)較正常小鼠和腫瘤組小鼠均下降,說明小鼠的免疫功能已處于抑制狀態(tài)。腹腔注射CY并灌服加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯的小鼠RBC、WBC水平、G-CSF活性較模型組有明顯的改善提高，證明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯能改善或恢復(fù)機(jī)體的免疫功能。

加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯由黃芪、當(dāng)歸、靈芝、阿膠、川芎等藥物組成。方中黃芪為君藥，具有增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的能力[7],可強(qiáng)體抗癌，提高機(jī)體的免疫力。臣藥用當(dāng)歸，與黃芪相輔相成,具有改善血供減輕炎癥反應(yīng)時(shí)的損傷[8]。阿膠大劑量使用能夠提高骨髓的造血功能，促進(jìn)健康人的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，通過補(bǔ)血提高體弱人群的免疫力，迅速補(bǔ)充疾病過程中消耗的氣血陰液,提高免疫力，是不可缺少的治療藥物[9]。靈芝和川芎均可提高機(jī)體免疫力，達(dá)到防癌抗癌的目的，全方共奏氣血相生之功。實(shí)驗(yàn)表明加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)小鼠免疫功能具有一定的恢復(fù)和增強(qiáng)作用，因此加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯可以作為臨床治療腫瘤疾病過程中放化療的輔助藥物[10]。

[1]陳鵲汀,朱惠學(xué),劉智勤,等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腫瘤術(shù)后化療增效減毒作用的臨床觀察[J].河北職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(5):54-55.

[2]李寶鴻,廉南.加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)腫瘤患者放化療增效減毒作用的臨床觀察[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2005(2):7-9.

[3]蘇穎,郭焱,朱娜.益氣方干預(yù)化療所致免疫功能低下作用機(jī)理的研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2010,12(12):1116-1117.

[4]李端.藥理學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2007.

[5]陳旭芳.粒細(xì)胞擊落刺激因子對(duì)腫瘤化療患者白細(xì)胞數(shù)及醫(yī)院感染的影響[J].中國腫瘤臨床與康復(fù),2009,6(3):196-197.

[6]郭焱,蘇穎,顧紅纓.運(yùn)用益氣方調(diào)節(jié)化療所致紅細(xì)胞減少癥的作用機(jī)理研究[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,11(5):14.

[7]陳新謙,金有豫.新編藥物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:716.

[8]宋錦葉,盂立強(qiáng),李曉攻.黃芪與當(dāng)歸的現(xiàn)代藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008,9(9):833-835.

[9]蘇穎,郭焱,劉智.益氣方對(duì)化療所致小鼠免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(1):3-4.

[10]郭焱,蘇穎,朱娜.益氣加減方對(duì)化療所致紅白細(xì)胞減少癥及免疫功能的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(9):806-807.