日本囊對蝦精莢再生能力的研究

林 莉,姚東明,林瓊武,李 飛

(廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院,福建 廈門 361102)

從20世紀(jì)70年代至今,我國的對蝦養(yǎng)殖業(yè)在經(jīng)歷了諸多磨難之后,已經(jīng)發(fā)展為漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)．日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)不僅具有個大、體色鮮艷悅目和肉質(zhì)口感好等特點(diǎn),同時還具有離水性好,適合活蝦運(yùn)輸和市場價格高的優(yōu)勢,而且,與凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)和中國明對蝦(Fennerpenaeuschinensis)在生態(tài)習(xí)性上有著很強(qiáng)的互補(bǔ)性．因此,日本囊對蝦在我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)扮演著越來越重要的角色．

目前,在對蝦繁殖生產(chǎn)方面,業(yè)者至今習(xí)慣沿用從自然海區(qū)捕獲的已交配的成熟雌蝦,而在對蝦生殖生物學(xué)研究方面,學(xué)者的興趣也主要集中在雌蝦的生殖系統(tǒng)及卵的發(fā)育[1-6],而對雄蝦相關(guān)的研究僅在雄蝦生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、促雄腺的結(jié)構(gòu)、作用及精子的形態(tài)、發(fā)生[7-10],輸精管內(nèi)精莢的超微結(jié)構(gòu)和形成[11-13],有關(guān)雄蝦精莢再生的研究只見一些零星的報(bào)道[14-16],迄今日本囊對蝦在精莢人工移植、經(jīng)產(chǎn)雌蝦再交配技術(shù)上尚未突破,因而有關(guān)精莢再生的研究更是難得一見,這也是日本囊對蝦養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化遠(yuǎn)不及凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦主要原因[2,16]．因此,開展日本囊對蝦精莢再生能力和再生精莢質(zhì)量的研究勢在必行．本文主要報(bào)道了日本囊對蝦精莢的若干重要參數(shù)、再生次數(shù)、再生時間間隔、再生精莢質(zhì)量差異以及具有不同精莢再生能力的個體在親蝦群體中比例分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以期為對蝦繁殖生物學(xué)和遺傳育種學(xué)提供理論資料,為日本囊對蝦雄親蝦資源的利用和保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)在漳州漳浦宏運(yùn)水產(chǎn)育苗場進(jìn)行．成熟雄蝦捕自臺灣海峽自然海區(qū),采用低溫木屑無水包裝法將親蝦運(yùn)至實(shí)驗(yàn)場;雌蝦是經(jīng)育苗場生產(chǎn)使用過的親蝦,處于即將脫殼或已蛻殼,購自漳浦大尾魚水產(chǎn)育苗場,采用蝦苗袋充氧且低溫(14～16 ℃)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)場．

雌、雄親蝦分開馴養(yǎng)．入池前經(jīng)緩慢升溫復(fù)蘇,再經(jīng)高錳酸鉀溶液(質(zhì)量濃度為30 g/m3)消毒處理,移入帶有海沙底的水泥池內(nèi)(水溫17～19 ℃,鹽度30～32,pH值7.8～8.3)進(jìn)行喂養(yǎng),養(yǎng)殖池長寬規(guī)格為423 cm×138 cm,水深(40±5) cm,全程充氣．雄親蝦在實(shí)驗(yàn)之前需在適宜的條件下暫養(yǎng)3～5 d．池內(nèi)不間斷通氣,每天進(jìn)行1次換水(日換水量為總水量的1/3～1/2)并使用虹吸管吸出殘餌和糞便,每日投餌次數(shù)為2次,分別為早上10:00和晚上19:00,早上投喂很少,晚上投喂量較多,日投餌量為親蝦體質(zhì)量的10%～20%,視攝食情況酌情增減,餌料為新鮮雜色蛤仔(Ruditapesvariegata)和近江牡蠣(OstrearivularisGould)．控制好光線、培育密度等．觀測到雌蝦即將產(chǎn)卵,將其移入促熟池[2]．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表1 日本囊對蝦的體長、體質(zhì)量及精莢若干參數(shù)(n=72)Tab.1 Body length、body weight and main parameters of spermatophore in Marsupenaeus japonicus(n=72)

1.2.1 親蝦個體標(biāo)記

將硬紙板剪成的圓形小片作為編號牌,用小刀刻上編號．制作時注意修整紙板邊緣,避免留下易對親蝦造成傷害的刺突．然后用尼龍繩將編號牌系在親蝦眼柄基部,作為個體標(biāo)記,方便實(shí)驗(yàn)中追蹤每尾雄蝦各自不同的精莢再生情況,同時在研究再生精莢質(zhì)量時,用此法對比個體內(nèi)不同批次的精莢質(zhì)量,從而消除不同雄蝦個體之間的差異,使結(jié)論更能反映不同批次精莢的真實(shí)情況．

1.2.2 精莢的采集

精莢的采集是以袁路等[15]和李飛[16]的人工擠壓法和洪心等[17]的夾取法為基礎(chǔ),將2種方法結(jié)合,即人工擠壓-夾取法,輕壓雄蝦第五步足基節(jié)的基部,然后用消毒鑷子取出精莢．采集完成后,把雄蝦放回暫養(yǎng)池,觀察其復(fù)蘇狀況,避免其出現(xiàn)側(cè)臥現(xiàn)象．

1.2.3 體外人工授精

采用濕法授精,即從性成熟的雌蝦中取出卵巢,并剪開精莢,同時將兩者在裝有過濾海水的培養(yǎng)皿中輕輕抖動,使精子、卵子于海水中充分混合,30 min后,用注射器吸棄海水,再注入新鮮過濾海水,重復(fù)換水3次后,吸取適量卵子于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)受精率．

1.2.4 精子活體染色

將精莢剪碎,讓精莢內(nèi)精子充分釋放,加入1 000 mL海水進(jìn)行稀釋,制成精子懸液．用伊紅苯胺黑染色法進(jìn)行染色,取5 μL精子懸浮液于載玻片中央,再滴加5 μL 0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))伊紅染液和5 μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯胺黑染液,使三者混合均勻,染色3 min,蓋上蓋玻片,在400×的顯微鏡下檢驗(yàn)．在顯微鏡下,活精細(xì)胞不被著色,死精細(xì)胞被染成紅色,而畸形精細(xì)胞則呈非圓球狀．

1.2.5 精莢再生的觀測

以海捕雄蝦原有精莢為初始精莢,在每次獲取精莢后,每天觀察手術(shù)后雄蝦精莢再生情況及不同雄蝦在人工獲取精莢條件下,精莢能夠再生的批次數(shù),記錄下不同批次精莢再成熟的時間．同時,采用擠壓-夾取法獲取再生精莢,測定其精子合格率、精子數(shù)、受精能力．建立親蝦個體檔案．實(shí)驗(yàn)親蝦共72尾,其中9尾親蝦無法完成精莢再生,63尾親蝦精莢可再生1次,表示為第1批再生精莢,記為F；58尾親蝦精莢可再生2次,表示為第2批再生精莢記為S；32尾親蝦精莢可再生3次,表示為第3批再生精莢記為T.

1.2.6 精莢若干參數(shù)的說明

精莢質(zhì)量:用擠壓-夾取法獲取新鮮精莢,以最小稱量單位為0.01 g的電子天平稱量每個精莢的質(zhì)量．

精子總數(shù):將每個精莢放入玻璃研缽中,并加入2 mL的生理鹽水,移液槍吸取200 μL到5 mL的離心管中,再加入2 800 μL生理鹽水,然后按照上述過程再稀釋1次．之后,用滴管吸取一定量的精子懸浮液,滴到計(jì)數(shù)板上,用常規(guī)細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)算精子數(shù)量．

精子數(shù)(25格×16格)=80小格內(nèi)細(xì)胞個數(shù)/8×400×10 000×稀釋倍數(shù)×2.

精子合格率=1-(死亡精子+畸形精子)/精子總數(shù)．

受精能力:采用濕法授精,以卵子的受精率作為衡量精莢的精子授精能力的指標(biāo)．

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS和Excel分析處理,數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”的形式表示．

2 結(jié) 果

2.1 日本囊對蝦精莢的主要參數(shù)及其相關(guān)性分析

海捕雄蝦經(jīng)暫養(yǎng),精莢首次成熟后所測的主要參數(shù)見表1,其中體質(zhì)量和精莢質(zhì)量的變異系數(shù)都比較大．體質(zhì)量、體長與精莢質(zhì)量的關(guān)系見圖1和2．

圖1 精莢質(zhì)量與蝦體質(zhì)量關(guān)系Fig.1 The correlation between spermatophore weight and body weight

圖2 精莢質(zhì)量與體長關(guān)系Fig.2 The correlation between spermatophore weight and body length

根據(jù)雙變量相關(guān)性分析結(jié)果,體長、體質(zhì)量、精莢質(zhì)量三者之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系(p<0.01)．精子合格率、受精能力、精子總數(shù)與其他變量之間的相關(guān)性都不高(p>0.05)．

2.2 日本囊對蝦精莢再生的次數(shù)和時間間隔

2.2.1 日本囊對蝦親蝦群體中不同精莢再生能力的個體占群體總數(shù)的比例分析

具有不同精莢再生能力的個體在親蝦群體中的比例分布見圖3．由圖可知,雄親蝦群體再生能力的不同個體比例在44.44%～87.50%內(nèi),且雄親蝦在一個蛻殼周期內(nèi)精莢可再生1～3次,平均為2次．

圖3 日本囊對蝦親蝦群體中具不同精莢再生能力的個體占總數(shù)的比例Fig.3 The proportion of individuals with various regeneration ability in the population of male broodstock M. japonicus during spermatophore regeneration

2.2.2 日本囊對蝦精莢再生的時間間隔及其差異分析

日本囊對蝦雄親蝦第2批及第3批再生精莢每次再生的時間見表2．

表2 不同批次精莢每次再生的時間Tab.2 Duration of different batches of spermatophore regeneration

對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行線性相關(guān)分析,可知無論是第2批精莢還是第3批精莢,它們前后2次再生時間均無顯著的線性相關(guān)關(guān)系．同時,第1次再生時間與第2次再生時間間隔不存在顯著差異(p>0.05);第2次再生時間與第3次再生時間間隔也不存在顯著差異(p>0.05)．

可以初步判斷,精莢再生的時間間隔為5～7 d,隨精莢再生次數(shù)的遞增間隔的時間有延長的態(tài)勢,但差異不明顯(p>0.05)．

2.3 日本囊對蝦不同批次再生精莢質(zhì)量的比較

以精莢質(zhì)量、精子總數(shù)、精子合格率及受精能力作為評判不同批次再生精莢質(zhì)量參數(shù),結(jié)果見表3,其中實(shí)驗(yàn)親蝦共72尾,9尾無法完成精莢再生．

由結(jié)果可知,在第1批次再生精莢中初始精莢在精莢質(zhì)量、精子總數(shù)、受精率上都極顯著地大于第1次再生精莢(p<0.01)．而初始精莢的精子合格率顯著高于第1次再生精莢(p<0.05)．

在第2批次再生精莢中第1次再生精莢精子總數(shù)少于第2次再生精莢,精子合格率、受精率高于第2次再生精莢．且第1次再生精莢與第2次再生精莢,在精子總數(shù)、精子合格率、受精率上都存在有極顯著差異(p<0.01)．第1次再生精莢質(zhì)量顯著高于第2次再生精莢質(zhì)量(p<0.05)．

在第3批次再生精莢中第2次再生精莢精子總數(shù)大于第3次再生精莢,但二者無顯著差異(p>0.05),第2次再生精莢的精子合格率、受精率都極顯著高于第3次再生精莢(p<0.01)．第2次再生精莢質(zhì)量顯著大于第3次再生精莢質(zhì)量(p<0.05)．

表3 不同批次再生精莢質(zhì)量的差異Tab.3 The differences of spermatophore quality between different regeneration batches

注：Fn0、Fn1表示第1批再生中初始精莢、第1次再生精莢;Sn1、Sn2表示第2批再生中第1次、第2次再生精莢;Tn2、

Tn3表示第3批再生中第2次、第3次再生精莢.

因此,精莢的質(zhì)量、精子合格率和受精能力隨再生次數(shù)增多呈下降趨勢,差異顯著(p<0.05)．而精子總數(shù)在不同批次隨再生次數(shù)增多總體呈上升趨勢,差異顯著(p<0.05);但在同一批次的再生精莢中精子總數(shù)呈現(xiàn)上下起伏波動,即在第1批次與第3批次中精子總數(shù)隨再生次數(shù)增加均下降,在第2批次中精子總數(shù)隨再生次數(shù)增加明顯上升(p<0.01)．

3 討 論

3.1 不同獲取精莢的方法對雄蝦精莢再生的影響

精莢獲取方式對雄蝦精莢再生的影響如何,已引起許多學(xué)者的關(guān)注．洪心[17]分別對斑節(jié)對蝦和長毛明對蝦(P.penicillatus)的雄親蝦采用擠壓法獲取精莢,發(fā)現(xiàn)斑節(jié)對蝦殼厚,不易獲得精莢,還會因操作不當(dāng)導(dǎo)致雄親蝦受傷死亡;而長毛明對蝦殼薄,雖可獲得精莢,但往往因擠壓時力度掌握不當(dāng),引起雄親蝦損傷,甚至死亡．另外,對2種雄親蝦采用虹吸法獲取精莢發(fā)現(xiàn)均無法吸出完整的精莢．張偉權(quán)等[18]應(yīng)用高頻電針法對凡納濱對蝦獲取精莢,發(fā)現(xiàn)用此方法獲取精莢的成功率及獲取精莢后雄蝦的存活率均為100%,且取得的精莢內(nèi)精子無需“獲能”即可使卵子授精．李飛[16]通過對比夾取法和電刺激法對日本囊對蝦精莢再生的影響,發(fā)現(xiàn)夾取法獲取多批次雄蝦精莢后,精莢質(zhì)量快速下降;而電刺激法獲取的精莢質(zhì)量相對較為穩(wěn)定．在本實(shí)驗(yàn)中采用擠壓-夾取法人工獲取再生精莢,發(fā)現(xiàn)在前2次人工獲取精莢后,雄蝦存活情況較為穩(wěn)定,死亡率不超過15%,但第3次人工獲取后,死亡率上升,至第4次人工獲取后,雄蝦全部死亡;且伴隨再生批次增加,對蝦再生精莢質(zhì)量呈下降趨勢,與前面研究相符合．Pratoomchart[19]和Rosas等[20]也報(bào)道其他種類在實(shí)驗(yàn)室條件下,再生精莢精子數(shù)量和質(zhì)量下降的研究結(jié)果．

可以認(rèn)為電刺激法對雄蝦傷害較小,精莢再生率高,獲取的精莢質(zhì)量相對較為穩(wěn)定;而夾取法對雄蝦傷害較大,機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)較強(qiáng),精莢的再生率和個體存活率逐漸降低,所獲取的多批次精莢的質(zhì)量快速下降．因此,本實(shí)驗(yàn)采用擠壓-夾取法獲取精莢較電刺激法在效果上有所欠缺,但此法操作簡便易行,且整個實(shí)驗(yàn)過程,盡可能地減少親體的損傷和死亡,獲得了完整、健康的實(shí)驗(yàn)精莢,達(dá)到了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果．且在選用養(yǎng)殖日本囊對蝦雄蝦精莢進(jìn)行人工受精時,應(yīng)當(dāng)挑選再生批次較少的雄蝦(即挑選精莢可再生1～2次的雄蝦)獲取精莢．

3.2 對蝦親蝦性腺再成熟能力的個體差異

雌親蝦性腺再成熟能力的個體差異問題已有很多報(bào)道[21-23]．林瓊武等[3]探討了日本囊對蝦再交配、親蝦多次產(chǎn)卵及其卵子質(zhì)量的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明日本囊對蝦親蝦多次產(chǎn)卵的卵徑、孵化率和無節(jié)幼體不受產(chǎn)卵次數(shù)的影響,而卵徑和無節(jié)幼體體長與再交配親蝦個體大小關(guān)系不明顯．雄蝦的精子合格率、受精能力反映的是精子質(zhì)量的指標(biāo),與前者相互對應(yīng),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其均與親體大小無關(guān)．袁路等[15]在對凡納濱對蝦的研究中也發(fā)現(xiàn),個體大小接近的凡納濱對蝦精莢質(zhì)量與精子質(zhì)量沒有顯著相關(guān)關(guān)系,雄蝦的精子數(shù)量與個體大小無關(guān),同樣與本文結(jié)果相一致．

在本實(shí)驗(yàn)中個體大小相近的對蝦的精莢質(zhì)量和精子數(shù)量沒有相關(guān)關(guān)系,這是因?yàn)榫v由精子團(tuán)、精莢基質(zhì)和精莢壁3部分組成,并不由精子團(tuán)單一決定[24],因此,質(zhì)量大的精莢精子數(shù)量不一定就多．對于甲殼動物十足類精莢,每個精莢內(nèi)所含有的精子數(shù)差異很大,一般范圍在幾個至幾百個不等,多的會達(dá)到上千個[13]．這表明精子是在精莢形成的過程中被隨機(jī)包被的．本研究還表明了精子數(shù)量與體長、體質(zhì)量和精子合格率均無顯著相關(guān)性．

因此,個體大小與精莢質(zhì)量并不具有顯著的相關(guān)性,以個體大小作為選擇優(yōu)質(zhì)日本囊對蝦精莢的考量標(biāo)準(zhǔn),可靠性不足．對于日本囊對蝦精莢質(zhì)量評價的間接指標(biāo),有待進(jìn)一步探索．

3.3 對蝦再生精莢的質(zhì)量問題

影響對蝦再生精莢的因素有很多．王清印等[14]、楊叢海等[25])研究了雌雄性比對中國明對蝦精莢再生的影響,認(rèn)為充足數(shù)量雌對蝦的存在對于雄蝦精莢的再生和發(fā)揮雄對蝦的交配能力可能有促進(jìn)和誘導(dǎo)作用．袁路等[15]研究了溫度、鹽度對凡納濱對蝦精莢再生和精子質(zhì)量的影響,認(rèn)為溫度與精莢質(zhì)量有一定的相關(guān)關(guān)系,溫度低,精莢較重．溫度在26 ℃時,對蝦精子質(zhì)量最好,溫度越高,蛻皮周期越短,精莢再生時間也越短,但精子質(zhì)量下降也很迅速．鹽度為15條件下精子發(fā)育良好．隨著實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖時間的延長和精莢再生次數(shù)的增加,對蝦的精子質(zhì)量總體呈下降趨勢,尤其在高溫和低鹽條件下易導(dǎo)致精子畸形．然而,再生批次的增加伴隨著再生精莢質(zhì)量下降,二者的聯(lián)系,在不同的蝦種間,可能存在差異．斑節(jié)對蝦第1次與第2次(間隔15 d)獲取的精莢,在精莢的質(zhì)量、精子的數(shù)量,以及畸形精子百分率上沒有差異,這就表明連續(xù)獲取精莢對精莢質(zhì)量不會有影響[26]．Gomes等[27]也曾連續(xù)6個星期觀察到,從斑節(jié)對蝦雄蝦身上獲取精莢,精子的質(zhì)量和數(shù)量不會下降．對凡納濱對蝦和細(xì)角濱對蝦(Litopenaeusstylirostris)連續(xù)獲取精莢,會導(dǎo)致精子數(shù)量和質(zhì)量的提高[28]．

獲取精莢的時間間隔也是影響因素之一．斑節(jié)對蝦2次獲取精莢的時間間隔在15 d時,并不影響精莢的總精子數(shù)和畸形精莢的數(shù)量,所以證明15 d的間隔是安全有效的[26]．但是Sampath等[29]也對斑節(jié)對蝦的2次獲取精莢的時間間隔做了研究,結(jié)果表明只有時間間隔小于6 d時,會導(dǎo)致精莢質(zhì)量下降．

日本囊對蝦再生精莢退化,將對實(shí)際應(yīng)用產(chǎn)生重大影響．通過改變溫度和鹽度等環(huán)境因子、調(diào)節(jié)雌雄性比、調(diào)整獲取精莢時間間隔、進(jìn)行切除眼柄、或是使用其他獲取精莢操作,能否改善再生精莢質(zhì)量,延緩甚至消除精莢再生退化,將是下一步研究的重點(diǎn)．

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