柱前衍生化-高效液相色譜法測定啤酒中的多胺

王利娜，金東日

(延邊大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)系，吉林 延吉 133002)

多胺是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的有機(jī)小分子物質(zhì)，主要包括腐胺(PUT)、尸胺(CAD)、精瞇(SPD)和精胺(SPM)等，它與細(xì)胞分化、增殖、發(fā)育有關(guān)，并能影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的代謝.食物是人體內(nèi)多胺的重要來源之一[1]，研究表明，多胺水平與腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在一定相關(guān)性[2]，因此如何準(zhǔn)確而快速地檢測出食物中多胺的含量具有重要意義.傳統(tǒng)的多胺檢測方法[3]主要采用氨基酸分析儀和紙電泳法，但這兩種方法存在樣品回收率低、檢測靈敏度不高的問題.目前多胺的檢測多采用衍生化的方法，即將多胺的氨基接在對(duì)熒光或紫外有吸收的基團(tuán)上，再通過液相色譜分離檢測.Tang等[4]人采用4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯作為衍生化試劑，用HPLC-UV檢測了啤酒中的多胺，但此方法分析時(shí)間較長，靈敏度較低.文獻(xiàn)[5]用衍生化試劑1-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)建立了分析啤酒中多胺含量的高效液相色譜法，本文依據(jù)文獻(xiàn)[5]的方法，對(duì)啤酒中多胺含量的測定進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

儀器有Shimadzu LC-6A系列液相色譜儀，UV檢測器，N2000色譜軟件(浙江大學(xué))，U-3100紫外-可見分光光度儀(Shimadzu)，Agilent HPLC-6410三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀.

1-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-4-甲基哌嗪(PPZ)、1,6-己二胺(DAH)、1,3-丙二胺(DAP)、腐胺(PUT)為梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品，尸胺(CAD)為百靈威科技公司產(chǎn)品，亞精胺(SPD)和精胺(SPM)為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，乙腈為色譜純，水為超純水，6種不同品牌啤酒購于延吉市的超市.

1.2 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(2)(迪馬，150 mm×4.6 mm，3 μm)，流動(dòng)相為水-有機(jī)溶劑(乙腈-甲醇,體積比為6∶4)，紫外檢測波長為362 nm，流速為0.5 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，梯度洗脫程序如表1所示.

表1 梯度洗脫程序

1.3 LC-MS

MS條件：ESI離子源，正離子模式，干燥氣溫度為300 ℃，干燥氣流量為3 L/min，霧化器壓力為15 psi，毛細(xì)管電壓為4 000 V，質(zhì)量范圍為200～1 300 Da.色譜條件同1.2.

1.4 試液

取PPZ(20.2 mg)溶解于1 mL乙腈溶液中，配成濃度為71.1 mmol/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存，臨用前稀釋.取適量DAD、CAD、PUT、SPD和SPM，分別加1 mL超純水溶解，再加10 mmol/L硼砂溶液使各多胺濃度均為5 mmol/L.取DAH 11.6 mg，加1 mL超純水溶解，再加10 mmol/L硼砂溶液使DAH濃度為30 μmol/L.

1.5 衍生化反應(yīng)

分別取7.0 mmol/L PPZ和50.0 μmol/L多胺溶液各150 μL置于聚丙烯管中，攪拌2 min后于60 ℃條件下反應(yīng)50 min.反應(yīng)液冷卻后，過0.22 μm膜，取濾液10 μL進(jìn)樣.

1.6 樣品處理

用0.45 μm濾膜過濾啤酒樣品，然后用0.1 mol/L硼砂溶液稀釋啤酒濾液1倍.向啤酒稀釋液加適量DAH后，按1.4衍生化反應(yīng)方法進(jìn)行衍生化.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外波長的選擇

PPZ紫外吸收光譜如圖1所示.PPZ在196 nm和362 nm波長處有明顯的紫外吸收峰，且362 nm處的吸光度最大，其摩爾吸光系數(shù)εmax=1.62×104，因此本實(shí)驗(yàn)以362 nm為檢測波長.

圖1 PPZ紫外吸收光譜圖

2.2 衍生化反應(yīng)及其條件

以CAD為例說明衍生化試劑PPZ與多胺的衍生化反應(yīng)(圖2).此反應(yīng)在硼砂介質(zhì)中進(jìn)行，生成CAD -PPZ衍生物([M+H]+=631.4，見圖3)，其衍生物在4 ℃條件下能保存3 d以上.堿性介質(zhì)及其濃度、衍生化試劑用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間都對(duì)衍生化反應(yīng)產(chǎn)生重要影響.由于在前期研究中已確定了該衍生化反應(yīng)的最佳條件[5]，因此本文直接采用該條件進(jìn)行衍生化.

圖2 PPZ與CAD衍生化反應(yīng)

圖3 CAD衍生物的MS譜圖

2.3 色譜分離

在Diamonsil C18(2)色譜柱上考察水-乙腈、水-甲醇、水-乙腈-甲醇等不同流動(dòng)相體系中多胺衍生物的分離效果.在以水-乙腈為流動(dòng)相時(shí)，多胺衍生物的色譜流出順序大體為DAP、PUT、CAD、SPD、DAH和SPM，其保留時(shí)間隨著流動(dòng)相中乙腈含量的增加而減少.當(dāng)流動(dòng)相水-乙腈的體積比為40∶60時(shí)，SPD和SPM的保留時(shí)間較長(>30 min)，且SPM峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重(見表2)；當(dāng)流動(dòng)相水-乙腈的體積比為10∶90時(shí)，DAP和PUT衍生物峰與PPZ峰重疊，但SPM拖尾情況未能得到改善；當(dāng)流動(dòng)相水-乙腈的體積比為30∶70或20∶80時(shí)，仍未能實(shí)現(xiàn)6種多胺的同時(shí)分離.在以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相中甲醇含量超過85%時(shí)，多胺流出順序?yàn)镈AP、PUT、SPD、CAD、SPM和DAH.當(dāng)以水-甲醇(體積比為10∶90)作為流動(dòng)相時(shí)，雖然SPM拖尾情況得到改善，但在梯度洗脫條件下仍無法實(shí)現(xiàn)6種多胺的同時(shí)分離.因此，本文采用水-甲醇-乙腈作為流動(dòng)相，用梯度洗脫方法對(duì)6種多胺衍生物進(jìn)行同時(shí)分離試驗(yàn).在梯度洗脫程序設(shè)計(jì)中，當(dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相起始濃度高(>78%)時(shí)，DAP與PUT峰沒有分離，有機(jī)相起始濃度低(<78%)時(shí)，出現(xiàn)不對(duì)稱的SPD和SPM峰；因此，流動(dòng)相中有機(jī)相起始濃度選為78%.在乙腈和甲醇混合有機(jī)相中，隨著乙腈含量的增加，分析時(shí)間縮短.當(dāng)有機(jī)相組成由2∶8(體積比)變換為4∶6(體積比)時(shí)，分析時(shí)間從35 min縮短到21 min.當(dāng)有機(jī)相中乙腈為70%時(shí)，CAD和SPD峰有部分重疊.經(jīng)過試驗(yàn)最后確定有機(jī)相的乙腈-甲醇體積比為6∶4.梯度洗脫程序如表1所示.在此梯度洗脫條件下，6種多胺衍生物達(dá)到基線分離，如圖4所示.

表2 多胺衍生物在不同乙腈濃度中的保留時(shí)間

圖4 PPZ空白色譜圖(a)和多胺衍生物色譜圖(b)

2.4 分析方法的評(píng)價(jià)

前期研究[5]中已報(bào)道了本文方法的線性回歸方程、線性范圍、最低檢出限、穩(wěn)定性等.

2.5 方法回收率

向啤酒中加入一定量的多胺和內(nèi)標(biāo)物(DAH)，按樣品處理方法處理，衍生化后直接進(jìn)行分析并根據(jù)線性回歸方程計(jì)算測定值回收率.結(jié)果如表3所示，多胺回收率在93.1%～105.8%范圍內(nèi).

表3 方法回收試驗(yàn)

2.6 啤酒中多胺的測定

取前處理的啤酒樣品，按照1.2和1.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn).典型的啤酒多胺色譜圖如圖5 a所示，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)各峰進(jìn)行確證的結(jié)果如圖5 b所示.6種不同品牌啤酒中多胺含量見表4.有些樣品中未能檢測到多胺的濃度，其原因可能是多胺的濃度低于本方法的檢出限.

圖5 啤酒中多胺的色譜(a)和標(biāo)準(zhǔn)加入法確證色譜圖(b)

表4 啤酒中多胺含量的測定

3 結(jié)論

本文將PPZ作為衍生化試劑與多胺反應(yīng)，該衍生化反應(yīng)條件溫和，生成的多胺衍生物較為穩(wěn)定.在常規(guī)ODS色譜柱和UV檢測器條件下，可同時(shí)分離、檢測多種多胺化合物，其檢測靈敏度較高，準(zhǔn)確度好，分析速度快.本方法可用于生物樣品和食品中多胺含量的檢測.

參考文獻(xiàn)：

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