響應(yīng)面法優(yōu)化大豆中植物甾醇的超聲提取工藝

（吉林大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130022）

植物甾醇是一種結(jié)構(gòu)上類似于膽固醇的植物活性成分，目前經(jīng)過鑒定的植物甾醇單體有250多種，最常見的五種成分是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷和菜油甾烷，其中含量較多的是β-谷甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾烷、菜油甾烷等，主要存在于油脂、豆類食物中[1-2]。由于其具有降膽固醇、降血脂、抑制腫瘤和抗氧化[3-8]等作用，在醫(yī)藥和食品工業(yè)有廣泛的應(yīng)用。2000年美國(guó)FDA批準(zhǔn)添加植物甾醇的食品可采用“健康聲稱”標(biāo)簽，2003年歐盟食品科學(xué)委員會(huì)（SCF）亦確證植物甾醇類食品的安全性。因此對(duì)植物甾醇的研究具有廣闊的市場(chǎng)前景。

目前植物甾醇的提取主要有回流法、溶劑法、微波輔助法、超聲輔助法等。其中回流法和溶劑法需要使用大量的萃取溶劑且萃取時(shí)間長(zhǎng)，而微波易導(dǎo)致溶液沸騰損失，因此本文采用超聲輔助法對(duì)大豆甾醇提取工藝進(jìn)行研究。

張澤生[9]、夏秋敏[10]、王麗波[11]和萬茵[12]等學(xué)者分別對(duì)米糠、蘋果籽、南瓜籽和梔子進(jìn)行了甾醇提取研究，尚未見從大豆中提取甾醇的研究報(bào)道。我國(guó)是大豆的起源地，也是全球保存栽培大豆種質(zhì)資源數(shù)量最多的國(guó)家，至今已收集保存3萬余份大豆資源；大豆產(chǎn)區(qū)主要在東北和黃淮海地區(qū)，2008年全國(guó)大豆播種面積達(dá)950萬公頃。而且大豆中甾醇含量高于青豆、黑豆和綠豆等[7]，因此本文采用響應(yīng)面法[13]優(yōu)化大豆中植物甾醇的超聲提取工藝，為大豆甾醇的工業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料、儀器設(shè)備和方法

1.1 材料與試劑

大豆：2012年2月購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

β-谷甾醇：分析標(biāo)準(zhǔn)品（＞95%），阿拉丁試劑（中國(guó)）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250DB型超聲波清洗儀：江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；MM721AAU-PW美的微波爐：美的微波電器制造有限公司；LD4-2A型低速離心機(jī)：北京市雷勃爾離心機(jī)有限公司；AL104型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；T22N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆中植物甾醇的幾種提取工藝

每次稱取3.00 g經(jīng)粉碎120 s～150 s的大豆粉，置于250mL帶塞錐形瓶中，按照20∶1（mL/g）液料比加入80%乙醇。工藝A：將錐形瓶置于45℃恒溫水浴鍋中低速振蕩2 h；工藝B：進(jìn)行119 W微波15 min；工藝C：進(jìn)行250 W超聲40 min；工藝D：先進(jìn)行119 W微波10 min，后進(jìn)行250 W超聲30 min；工藝E：先進(jìn)行250 W超聲30 min，后進(jìn)行119 W微波10 min。經(jīng)過上述提取工藝后，進(jìn)行4 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定總甾醇含量。

1.3.2 大豆中植物甾醇的超聲提取

每次稱取3.00 g經(jīng)粉碎120 s～150 s的大豆粉，置于250 mL帶塞錐形瓶中，加入80%乙醇進(jìn)行超聲提取。然后進(jìn)行4 000 r/min離心5min，取上清液測(cè)定總甾醇含量。

1.3.3 試驗(yàn)指標(biāo)及方法

總甾醇含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[14] 中的硫磷鐵法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每次提取試驗(yàn)重復(fù)兩次，采用Excel 2003軟件計(jì)算，取平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（BBD），并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照文獻(xiàn)[14] 中的硫磷鐵法，建立β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)Excel 2003軟件計(jì)算，得到回歸方程y=5.467x+0.004，式中y為吸光度值，x為β-谷甾醇溶液濃度（mg/mL）；該方程相關(guān)系數(shù)R2=0.998 6，說明曲線回歸性很好，可以用于定量分析。

2.2 大豆中植物甾醇提取工藝的比較

大豆粉在不同工藝條件下進(jìn)行提取，試驗(yàn)方法見1.3.1，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 大豆中植物甾醇不同提取工藝的比較Fig.1 Comparison of different extraction process of phytosterols from soybean

由圖1可知，采用119W微波15min或250W超聲40min進(jìn)行提取，總甾醇提取率分別為（3.91±0.04）mg/g、（4.02±0.23）mg/g，與45℃水浴2h的提取率（4.04±0.63）mg/g接近，提取時(shí)間卻分別縮短了87.5%、66.7%。因此，超聲法、微波法是較好的提取方法。

另外用乙醇作為提取溶劑，在119 W微波15 min后，乙醇體積損失了40%。同時(shí)，采用先超聲30 min后續(xù)微波10 min提取的總甾醇提取率（4.55±0.29）mg/g比單獨(dú)超聲 40 min的提取率（4.02±0.23）mg/g稍高，但考慮到工藝的方便性，選擇超聲波法（工藝C）提取大豆中植物甾醇。

2.3 大豆中植物甾醇超聲提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 超聲時(shí)間對(duì)總甾醇提取率的影響

大豆粉以20∶1（mL/g）液料比在超聲功率250 W下分別提取 20、30、40、50、60、70 min，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)總甾醇提取率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on the total phytosterols extraction rate

由圖2可知，從20 min～40 min總甾醇提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，總甾醇提取率達(dá)最大；從40 min～70 min總甾醇提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢減少。

2.3.2 超聲功率對(duì)總甾醇提取率的影響

大豆粉以20∶1（mL/g）液料比分別在超聲功率為125、150、175、200、225、250 W 下提取 40 min，試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對(duì)總甾醇提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the total phytosterols extraction rate

由圖3可知，從125 W～175 W總甾醇提取率隨著超聲功率的增大而增加；從175 W～250 W總甾醇提取率增加的幅度不大。

2.3.3 液料比對(duì)總甾醇提取率的影響

大豆粉分別以10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）液料比在超聲功率250 W下提取40 min，試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 液料比對(duì)總甾醇提取率的影響Fig.4 Effects of liquid to solid ratio on the total phytosterols extraction rate

由 4 可知，液料比從 10 ∶1（mL/g）～20 ∶1（mL/g）總甾醇提取率逐漸增加；從 20 ∶1（mL/g）～25 ∶1（mL/g）總甾醇提取率緩慢增加；從 25 ∶1（mL/g）～30 ∶1（mL/g）總甾醇提取率卻略有下降。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 BBD試驗(yàn)及其結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行BBD優(yōu)化甾醇超聲提取試驗(yàn)，以總甾醇提取率（mg/g）為響應(yīng)值y，其因素水平及編碼見表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2～表3。

表1 自然因素水平編碼表Table 1 Level code of natural factors

表2 BBD試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results of BBD experiment

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

通過Design Expert 8.0.5軟件分析，得到關(guān)于編碼因素的回歸方程為：

y=3.52+0.26x1+0.20x2+0.25x3+0.12x1x2-0.012x1x3+0.015x2x3-0.13x12+0.076x22+0.025x32

由表3可知，方程的F值為11.43，大于F0.01（9，7）=6.71，說明拒絕零假設(shè)，即在顯著性水平0.01下認(rèn)為該回歸方程是顯著的；失擬項(xiàng)的F值為3.12，小于F0.25（3，4）=2.05，說明該方程是不失擬的，即擬合得好。此外，該回歸方程的R2值為0.936 3，說明方程擬合得好。

2.4.2 響應(yīng)曲面圖及其分析

通過DesignExpert8.0.5軟件分析，獲得因素交互作用的響應(yīng)曲面圖（見圖5～圖7）。由響應(yīng)曲面分析得到最佳工藝條件為：超聲時(shí)間為40min、超聲功率為200W、液料比為 25∶1（mL/g），此時(shí)總甾醇提取率為 4.33mg/g。采用上述工藝條件重復(fù)兩次試驗(yàn)，測(cè)得的總甾醇提取率平均值為4.21mg/g。與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為-2.74%，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝參數(shù)是可靠的。

圖5 y=f（x1，x2）響應(yīng)曲面圖Fig.5 3D surface graph of y=f（x1，x2）

圖6 y=f（x1，x3）響應(yīng)曲面圖Fig.6 3D surface graph of y=f（x1，x3）

圖7 y=f（x2，x3）響應(yīng)曲面圖Fig.7 3D surface graph of y=f（x2，x3）

3 結(jié)論

1）采用溶劑法2 h、119 W微波15 min或250 W超聲40 min進(jìn)行大豆中植物甾醇的提取，三者總甾醇提取率接近，但后兩者在提取時(shí)間上分別縮短了87.5%、66.7%；采用119 W微波15 min后乙醇體積損失了40%。從節(jié)約提取時(shí)間、減少溶劑損失的角度選擇超聲波法提取大豆中植物甾醇。

2）利用Box-Behnken響應(yīng)面法建立了大豆中植物甾醇超聲提取的回歸方程（R2=0.936 3）：

y=3.52+0.26x1+0.20x2+0.25x3+0.12x1x2-0.012x1x3+0.015x2x3-0.13x12+0.076x22+0.025x32

3）通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到大豆中植物甾醇超聲提取的最佳工藝條件：超聲功率200 W、超聲時(shí)間40 min、液料比 25 ∶1（mL/g），在此條件下大豆中總甾醇提取率為4.33 mg/g；實(shí)際測(cè)定值與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為-2.74%，二者基本吻合，為大豆甾醇的工業(yè)化提取應(yīng)用提供參考。

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