深海紅魚膠原蛋白的超聲波輔助提取及其理化特性

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（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江科華漁業(yè)發(fā)展有限公司，江蘇鎮(zhèn)江 212134）

我國(guó)是漁業(yè)大國(guó)，但由于加工水平較低，大量加工廢棄物造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。膠原蛋白可被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域，但近年來(lái)瘋牛病、口蹄疫、豬鏈球菌、H1N1流感等傳染病的頻繁暴發(fā)，使傳統(tǒng)上畜禽來(lái)源膠原蛋白的安全性越來(lái)越讓人擔(dān)心；同時(shí)，宗教和習(xí)俗原因也使其應(yīng)用受到一定的限制[1]。因此，從水產(chǎn)品加工廢棄物中分離可以替代畜禽來(lái)源的膠原蛋白，對(duì)于提高漁業(yè)效益、減少環(huán)境污染、促進(jìn)食品安全具有重要意義。

目前，膠原蛋白的提取主要有鹽法、酸法和酶法。鹽法和酸法僅能將組織中新生成的沒(méi)有形成分子間交聯(lián)或交聯(lián)度較低的膠原蛋白抽提出來(lái)，因而提取率較低；酶法可以特異性地水解膠原蛋白末端交聯(lián)部位，提取率較高，但酶解速率較低，一般需要2 d時(shí)間[2]。近年來(lái)，超聲波技術(shù)吸引了越來(lái)越多人的注意，已廣泛應(yīng)用于多種生物活性物質(zhì)的制備，如生物堿、類黃酮、油脂、多糖、蛋白質(zhì)等，其空化、湍動(dòng)、微擾、界面、聚能等效應(yīng)有力地促進(jìn)了溶劑向生物材料的滲透和目標(biāo)物質(zhì)向溶劑的釋放，從而顯著提高目標(biāo)物質(zhì)的提取效率[3]。

深海紅魚（Sebastes mentella）是一種非常重要的商業(yè)魚種，主要分布于北大西洋海域，廣泛應(yīng)用于生魚片、魚糜制品的生產(chǎn)，年捕撈量超過(guò)10萬(wàn)t，其加工廢棄物占年捕撈量的50%～70%。本研究首次將超聲波技術(shù)引入深海紅魚膠原蛋白的制備過(guò)程，優(yōu)化提取工藝關(guān)鍵參數(shù)，明確膠原蛋白理化特性，以期為其高效生產(chǎn)和潛在應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

深海紅魚（Sebastes mentella）由連云港三星食品有限公司提供，2010年夏季捕撈于冰島海域，體長(zhǎng)30cm～35 cm，去除魚鱗及皮下組織后，將魚皮用自來(lái)水清洗干凈，瀝干，剪碎（約2×2 mm），－20℃貯藏。

蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)：德國(guó)MBI；氨基酸標(biāo)樣：美國(guó)Sigma；電泳試劑：德國(guó)Merck；其它藥品：國(guó)藥集團(tuán)；JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝；EPS604垂直電泳系統(tǒng)：南京科寶；MLC-703氨基酸自動(dòng)分析儀：日本Hitachi；170-SX 紅外光譜儀：美國(guó) Nicolet。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將魚皮于20%NaCl（0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）溶液中（1∶20，w/v），均質(zhì) 2 min后 5 000 g× 15 min離心，取沉淀，重復(fù)該操作直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗，凍干。

1.2.2 膠原蛋白的提取

將原料置于預(yù)冷水中（1∶100，w/v）進(jìn)行超聲波處理，然后加入乙酸和胃蛋白酶分別至0.5 mol/L和0.1%（w/v）提取膠原蛋白，高速離心（20 000 g×60 min）后，向上清液中加入NaCl至0.9 mol/L鹽析，離心（5 000 g×15 min）后將沉淀溶解于1.0 mol/L NaCl（0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.5），再次高速離心（20 000 g× 60 min）取上清液，加入NaCl至2.4mol/L鹽析，離心（10000g×20min）后取沉淀溶解于0.5 mol/L乙酸，透析，凍干，即為膠原蛋白。所有操作均在4℃下進(jìn)行。膠原蛋白的提取率（%）按如下公式計(jì)算：

1.2.3 超聲波輔助提取膠原蛋白工藝的優(yōu)化

采用響應(yīng)曲面法Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行膠原蛋白提取工藝的優(yōu)化。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇了提取時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間作為關(guān)鍵因子，因素水平設(shè)計(jì)如表1所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型建立應(yīng)用軟件Design Expert 6.0進(jìn)行。

1.2.4 膠原蛋白理化特性分析

羥脯氨酸含量根據(jù)ISO 3496-1994方法測(cè)定；氨基酸組成通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)膠原蛋白酸解產(chǎn)物得到；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）采用5%分離膠與3%濃縮膠不連續(xù)垂直電泳系統(tǒng)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色分析；傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（FTIR）利用KBr壓片法獲得。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因子水平及編碼Table 1 Experimental levels and codes of the factors used in Box-Behnken design

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立樣品測(cè)定的平均值表示；統(tǒng)計(jì)分析利用Student's t檢驗(yàn)和一維方差分析（ANOVA），多重比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD）；P＜0.05被認(rèn)為存在顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輔助提取膠原蛋白工藝的優(yōu)化

表2顯示了響應(yīng)曲面法Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣與膠原蛋白提取率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得了膠原蛋白提取率（Y）與提取時(shí)間（A）、超聲功率（B）、超聲時(shí)間（C）的回歸模型：

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)矩陣與膠原蛋白提取率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值Table 2 Box-Behnken design matrix along with the experimental and predicted values of collagen yield

Y=-73.13000+6.65925A+0.14196B+7.62402C-0.204 68A2-0.000 203 24B2-0.172 62C2+0.005 157 5AB-0.067 312AC-0.001 373 0BC

圖1顯示了各因子交互作用對(duì)膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線，從該圖和方差分析可知，提取時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間及其交互作用對(duì)膠原蛋白的提取率均存在顯著影響?？偟膩?lái)說(shuō)，隨著提取時(shí)間、超聲功率和超聲時(shí)間的增加，膠原蛋白提取率逐漸增大，達(dá)到最高點(diǎn)后，可能由于膠原蛋白的變性或分解，提取率又有所下降。

圖1 交互作用對(duì)膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面和等高線（A：超聲時(shí)間20 min；B：超聲功率500 W；C：提取時(shí)間16 h）Fig.1 Fitted response surface and corresponding contour of interaction effect on collagen yield.（A:ultrasonic time 20 min;B:ultrasonic power 500 W;C:extraction time 16 h）

從二次多項(xiàng)式模型的方差分析（表3）中可以看出，該回歸模型極顯著（P＜0.000 1）；失擬項(xiàng)不顯著（P=0.804 4）；相關(guān)系數(shù)（R）為 0.997 8，表明實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值較為一致；校正決定系數(shù)（R2Adj）為0.990 0，說(shuō)明該模型擬合較好，誤差較小，99%的變異分布在所研究的3個(gè)關(guān)鍵因子中，總變異度中僅有1%不能由該模型來(lái)解釋，可用于分析和預(yù)測(cè)任何組合條件下的提取率。

表3 二次多項(xiàng)式擬合模型方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

通過(guò)Design Expert軟件優(yōu)化獲得深海紅魚膠原蛋白的最佳提取條件：提取時(shí)間18 h，超聲功率505 W，超聲時(shí)間15 min。在此條件下，膠原蛋白的提取率為93.6%，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了該模型的精確性（R=0.9956，提取率94.2%）。與傳統(tǒng)方法的提取率（92.2%）相比，超聲波輔助提取率沒(méi)有顯著性差異，但提取時(shí)間從48 h縮短到了18 h，顯著提高了制備效率。

2.2 膠原蛋白的理化特性分析

2.2.1 氨基酸組成

表4顯示了深海紅魚膠原蛋白的氨基酸組成，其中甘氨酸的含量最高，約占氨基酸總量的1/3；丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸和絲氨酸含量也相對(duì)較高，而酪氨酸、組氨酸和羥賴氨酸含量相對(duì)較低；此外，與其它魚種相同，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)色氨酸和半胱氨酸的存在[1，4-5]?？倎啺被幔ǜ彼?、羥脯氨酸）含量為16.0%，顯著低于溫帶和熱帶魚種來(lái)源的膠原蛋白（18%～20%），而與冷水魚種相似（16%～18%），這也說(shuō)明該膠原蛋白可能具有較低的熱穩(wěn)定性[6-7]。

表4 深海紅魚膠原蛋白的氨基酸組成（殘基數(shù)/1 000個(gè)殘基）Table 4 Amino acid profile of collagen from deep-sea redfish（residues/1 000 residues）

2.2.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

圖2顯示了深海紅魚膠原蛋白的SDS-PAGE圖譜?？偟膩?lái)說(shuō)，該膠原蛋白與其它魚種來(lái)源的膠原蛋白圖譜相似，至少含有兩種不同遷移率的α鏈（α1鏈和α2鏈）及其交聯(lián)鏈（β鏈），并且α1鏈的強(qiáng)度顯著高于α2鏈[8-9]。根據(jù)電泳圖譜的條帶組成及其遷移率，可以判斷該膠原蛋白主要為I型，這一結(jié)果與Nile perch、black drum、sheepshead seabream、bigeye snapper、Brownstripe red snapper等魚種相似[1，8，10-11]。此外，該膠原蛋白也可能有α3鏈存在，但其具有和α1鏈相同的遷移率，因而無(wú)法在此凝膠上將其和α1鏈區(qū)分開(kāi)來(lái)[12-13]。

圖2 深海紅魚膠原蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE pattern of collagen from deep-sea redfish

2.2.3 傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（FTIR）

圖3和表5顯示了深海紅魚膠原蛋白的FTIR光譜及其主要吸收峰的歸屬，與其它魚種來(lái)源的膠原蛋白相似但又不盡相同，和酸法制備的深海紅魚膠原蛋白也略有不同，這表明不同魚種、不同方法制備的膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)存在一定差異[14-15]。

圖3 深海紅魚膠原蛋白的FTIR光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of collagen from deepsea redfish

表5 深海紅魚膠原蛋白FTIR光譜峰位及其歸屬Table 5 FTIR spectra peak locations and assignment for collagen from deep-sea redfish

具有完整三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白的1 240 cm-1（Amide III）峰與1 454 cm-1峰面積比為1.0，而該膠原蛋白約為1.2，說(shuō)明其三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微變化，這可能是由于其N末端和C末端的酶解丟失而引起的[16] 。

Amide A峰與N-H伸縮振動(dòng)有關(guān)[14]。根據(jù)Doyle理論，游離的N-H伸縮振動(dòng)在3 400 cm-1～3 440 cm-1之間，而當(dāng)N-H形成了氫鍵，其振動(dòng)頻率則會(huì)顯著降低，通常為3 300 cm-1左右[17]，而該膠原蛋白則在3 328 cm-1（表5），這說(shuō)明其中較多的N-H參與了維持膠原蛋白特有三股螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵的形成[11]。

3 結(jié)論

1）獲得了超聲波輔助提取深海紅魚膠原蛋白的最佳工藝：提取時(shí)間18 h、超聲功率505 W，超聲時(shí)間15 min。在此條件下，膠原蛋白的提取率（93.6%）與傳統(tǒng)方法無(wú)顯著性差異，但提取時(shí)間縮短了30 h。

2）深海紅魚膠原蛋白主要為I型，具有較低的亞氨基酸含量（16.0%），由于N末端和C末端非螺旋區(qū)的丟失，其分子結(jié)構(gòu)有所改變，但大量氫鍵的存在使其三股螺旋結(jié)構(gòu)仍占主導(dǎo)地位。

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