解淀粉芽孢桿菌對山茶灰斑病菌的抑制作用1)

張 靜 冉曉瀟 朱天輝 彭 艷 劉 洋

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

解淀粉芽孢桿菌對山茶灰斑病菌的抑制作用1)

張 靜 冉曉瀟 朱天輝 彭 艷 劉 洋

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625014)

解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)及其分泌物對山茶灰斑病病原菌茶褐斑擬盤多毛孢(Pestalotiopsisguepini(Desm.) Stey)具有較好的拮抗作用。采用正交試驗(yàn)法探究了碳源、氮源、pH值、溫度、接種量等因子對解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的影響。結(jié)果表明：最佳碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。最佳優(yōu)化條件為25 ℃、蛋白胨0.3 g、葡萄糖0.5 g、pH值6.0、每125 mL接種2 mL孢子懸液于300 mL錐形瓶中震蕩培養(yǎng)?；谏L曲線的測定，通過研究解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)時間與代謝產(chǎn)物拮抗活性的關(guān)系，得到解淀粉芽孢桿菌對茶褐斑擬盤多毛孢的最佳作用時間為72 h，抑菌值達(dá)0.85。

解淀粉芽孢桿菌；茶褐斑擬盤多毛孢；正交試驗(yàn)；抑菌活性

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-122～125

Bacillusamyloliquefaciensand its antagonistic substance can effectively antagonizePestalotiopsisguepini(Desm.) Stey. By orthogonal design method, we studyied the effects of varied factors on antagonistic substance producing ofB.amyloliquefaciens, including carbon source, nitrogen source, cultural pH, temperature, medium oxygen and inoculated volume. The optimal carbon source and nitrogen source were glucose and peptone, and the optimal fermentation conditions were with 28 ℃, pH of 7, peptone of 0.3 g, and 125 mL medium volume in 300 mL triangle flask bulk with 2 mL inoculating volume. By studying the growth curve and the relationship between culture time and antagonistic activities, we got the bactriostatic effect ofB.amyloliquefaciensonP.guepini, and when the optimal reaction time was 72 h, the inhibiting rate was up to 85%.

KeywordsBacillusamyloliquefaciens; Fermentation condition; Orthogonal trial; Antifungal activity

山茶(Camelliajaponica)生長發(fā)育過程中易受多種病原菌侵染[1-2]，其中由茶褐斑擬盤多毛孢(Pestalotiopsisguepini(Desm.) Stey)侵染所致山茶灰斑病發(fā)生十分普遍，極大危害山茶的觀賞價值，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是從山茶組織內(nèi)分離得到的一種內(nèi)生拮抗細(xì)菌，對該病原菌具有明顯的抑制作用。但目前對山茶灰斑病的研究僅限于病原菌生物學(xué)特性[5]及化學(xué)防治[6]方面，對利用寄主內(nèi)生拮抗細(xì)菌防治山茶灰斑病方面的研究未見報道。芽孢桿菌屬是一類能夠產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子、低分子抗生素[7]以及抗菌蛋白多肽類活性物質(zhì)[8]的桿狀細(xì)菌，對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用[9-12]，因而被廣泛應(yīng)用于生防制劑的研究[13]。目前，對于芽孢桿菌屬的生防研究主要集中在枯草芽孢桿菌[14-15]、蠟狀芽孢桿菌[16]、多粘芽孢桿菌[17]等，對解淀粉芽孢桿菌高產(chǎn)抗菌物質(zhì)和生防特性方面的研究還不夠完善。就此，本研究以解淀粉芽孢桿菌為研究對象，對其培養(yǎng)基最佳碳、氮源和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，對其抗病機(jī)制和抑菌成效進(jìn)行研究，旨在為該菌抑菌活性物質(zhì)的鑒定、生防制劑開發(fā)，及山茶灰斑病的生物防治提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌BA10菌株，病原菌為茶褐斑擬盤多毛孢菌，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.2 樣品制備

①拮抗菌發(fā)酵液：接種解淀粉芽孢桿菌于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后用無菌水洗下，25 ℃，140 r/min，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)72 h，待用。②無菌濾液：取發(fā)酵液，10 000 r/min，4 ℃，離心10 min，棄沉淀，得上清液，后用0.22 μL細(xì)菌過濾器過濾得到病原菌無菌濾液。③病原菌菌餅：將活化的茶褐斑擬盤多毛孢菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2～3 d后用打孔器打孔(直徑為5 mm)得菌餅，待用。

1.3 抗菌活性的測定

取2 mL無菌濾液于培養(yǎng)皿中，另取融化且冷卻45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基20 mL倒入其中，充分混勻后靜置，待培養(yǎng)基冷卻后，接入菌餅，平放于恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)，用十字交叉法分別測定第4天，第5天菌落直徑，不加培養(yǎng)液為對照，每處理重復(fù)3次，取平均值，計算抑菌值。抑菌值=相對菌落直徑/對照菌落直徑。

1.4 解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)條件的篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，碳源分別選用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖(用量0.5%)；氮源分別選用(NH4)2SO4、NH4NO3、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏(用量0.1%)。室溫下，300 mL三角瓶裝150 mL培養(yǎng)基，分別接種2 mL解淀粉芽孢桿菌種子液，140 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，設(shè)計2因素5水平正交試驗(yàn)L20(52)進(jìn)行優(yōu)化，每處理重復(fù)3次，確定培養(yǎng)基最佳碳、氮源。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

根據(jù)優(yōu)化后的碳、氮源培養(yǎng)基，采用正交表L25(56)(表1)設(shè)計6因素5水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行搖瓶試驗(yàn)，選擇最優(yōu)培養(yǎng)條件，每個處理設(shè)置3次重復(fù)，以B.amyloliquefaciens對P.guepini的抑菌值為結(jié)果檢驗(yàn)指標(biāo)[18]。參照1.3進(jìn)行抑菌活性檢測。

表1 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件的試驗(yàn)因子及水平

注：培養(yǎng)條件140 r/min，72 h。

1.6 解淀粉芽孢桿菌生長量與代謝產(chǎn)物抑菌作用的關(guān)系

生長曲線的測定：以最優(yōu)方案搖床培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌63瓶，3組重復(fù)，每組21瓶，接種開始計時，每隔6 h取一瓶，在波長650 nm處測各無菌發(fā)酵液OD值，接菌初始時OD 值為對照，直至測完21瓶，最后以發(fā)酵時間為橫軸，以3組無菌發(fā)酵液OD650平均值為縱軸作生長曲線。

抑菌活性曲線的制作：離心取上層清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原來的1/2，后用細(xì)菌過濾器抽濾制成無菌代謝產(chǎn)物，取2 mL制成含藥平板，接種菌餅后測定解淀粉芽孢桿菌對茶褐斑擬盤多毛孢的抑菌作用，接菌初始時OD值為對照，直至測完21瓶，最后以發(fā)酵時間為橫軸，以3組無菌發(fā)酵液的抑菌均值為縱軸作抑菌活性曲線，與生長曲線對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳碳、氮源

由表2可知，不同的碳、氮源組合對解淀粉芽孢桿菌抑菌效果的影響呈顯著性差異。接種菌餅后第2天，P.guepini呈不同趨勢生長，部分菌生長幅度與對照等同，但菌絲明顯萎縮變形；部分菌只長到培養(yǎng)皿1/2半徑處便停止生長，且菌絲肉眼辨別不明顯；更有部分菌餅處逐漸變黑，幾乎無菌落增長。方差分析(表2)可知，解淀粉芽孢桿菌在葡萄糖和蛋白胨處理時無菌濾液對P.guepini的拮抗效果最好，抑菌值達(dá)到0.81，而乳糖和NH4NO3處理時無菌濾液的拮抗效果最差，為0.13。由此得出，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。

表2 解淀粉芽孢桿菌碳、氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果及顯著性

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件

以篩選出的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)，在25組解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基發(fā)酵條件下的抑菌值分別為：0.596±0.053、0.860±0.031、0.484±0.077、0.518±0.039、0.563±0.046、0.658±0.004、0.651±0.021、0.567±0.043、0.834±0.022、0.645±0.008、0.559±0.066、0.574±0.036、0.586±0.021、0.429±0.047、0.464±0.042、0.676±0.065、0.156±0.016、0.446±0.085、0.184±0.035、0.193±0.026、0.154±0.019、0.207±0.087、0.229±0.090、0.164±0.062、0.160±0.06。極差分析結(jié)果見表3。在L25(56)正交試驗(yàn)中，每個因子均作5個區(qū)組處理，溫度T2區(qū)組(25 ℃)的抑菌總值最大(10.068)，T5區(qū)組(40 ℃)抑菌總值最小(2.746)，因此，判斷25 ℃為解淀粉芽孢桿菌拮抗效果的最適溫度；同理，pH區(qū)組T1的抑菌總值顯著高于其他區(qū)組，6.0為最佳pH值；T4區(qū)組125 mL為最佳瓶裝量；T2區(qū)組2 mL為最佳接種量；而T2、T3區(qū)組的0.5 g/L和0.3 g/L為最適碳源、氮源。通過對正交試驗(yàn)結(jié)果的極差(表3)和方差分析(表4)可知，各因素對解淀粉芽孢桿菌的拮抗效果的影響差異極顯著，在培養(yǎng)條件范圍內(nèi)，影響解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)最主要的因素是溫度，其次是接種量、碳源和pH。

根據(jù)表3綜合得出，25 ℃條件下，pH值6.0，蛋白胨0.3 g，葡萄糖0.5 g，接種量2 mL，每125 mL接種2 mL孢子懸液于300 mL錐形瓶中振蕩培養(yǎng)時解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)拮抗物質(zhì)的抑菌效果最好。在此發(fā)酵條件下，解淀粉芽孢桿菌無菌代謝產(chǎn)物對茶褐斑擬盤多毛孢的抑菌值高達(dá)0.85，菌落增長幅度明顯受到抑制，菌絲肉眼無法辨認(rèn)。由此得知，該條件即為解淀粉芽孢桿菌高產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件。

表3 解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)基發(fā)酵條件極差分析結(jié)果

注：T為各指標(biāo)總和。

表4 解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵條件方差分析結(jié)果

注：** 為P<0.01；*為P<0.05；F0.05(4,70)=2.5；F0.01(4,70)=3.6。

2.3 解淀粉芽孢桿菌生長曲線及抗菌曲線

結(jié)合生長曲線及抑菌作用曲線可知，0～24 h抑制效果緩慢加強(qiáng)，但抑制率均低于0.10，此時菌體生長緩慢；24～72 h由于菌體生長迅速，抑菌活性也大幅度增強(qiáng)；72 h抑菌活性達(dá)到最高峰，解淀粉芽孢桿菌拮抗產(chǎn)物對P.guepini的抑制率高達(dá)0.85；72 h后由于解淀粉芽孢桿菌生長開始衰退，因此抑菌作用也急劇下降。由此得出，解淀粉芽孢桿菌對P.guepini的抑菌作用強(qiáng)度隨接種時間的延長呈現(xiàn)先上升后緩慢下降規(guī)律，最佳作用時間為接種后的72 h(圖1)。

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生具有抗菌作用的低分子量抗生素及抗菌脂肽類活性物質(zhì)[19]。但其所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)易受外部環(huán)境影響，不同環(huán)境條件可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種脂肽代謝產(chǎn)物[20]，因此研究培養(yǎng)基碳、氮源組成成分和發(fā)酵條件的選擇對于提高解淀粉芽孢桿菌高效生產(chǎn)拮抗物質(zhì)意義重大。

培養(yǎng)基成分優(yōu)化試驗(yàn)表明，葡萄糖和蛋白胨是解淀粉芽孢桿菌最適宜的碳、氮源，不同碳、氮源組合對菌株生長影響顯著，這與Caldeira等的結(jié)論[21]一致。而麥芽糖和蛋白胨組合對病原菌也具有明顯的抑制作用，但由于麥芽糖的價格過高，與大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及市場需求原則相悖，故不作考慮[22]。此外，解淀粉芽孢桿菌對培養(yǎng)溫度、pH、接種量、瓶裝量等因子要求較高。方差分析表明，最佳優(yōu)化條件皆與其它水平呈顯著性差異，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件顯著提高了解淀粉芽孢桿菌的抑菌活性，使得茶褐斑擬盤多毛孢菌落生長受到阻礙，明顯抑制了菌絲的萌發(fā)和分生孢子的產(chǎn)生，達(dá)到防治山茶灰斑病的效果。

圖1 培養(yǎng)時間與代謝產(chǎn)物抗菌活性及生長趨勢的關(guān)系

解淀粉芽孢桿菌生長曲線和抑菌活性曲線表明，解淀粉芽孢桿菌的生長趨勢與其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)數(shù)量具有一定的關(guān)系，即其抗菌活性高低與生長速率呈正相關(guān)，在72 h同時達(dá)到生長及抗菌活性峰值，之后隨著菌體衰退、分解甚至死亡等自身?xiàng)l件限制而表現(xiàn)為菌株生產(chǎn)的降低，但究竟是代謝產(chǎn)物的作用或是其他作用還有待進(jìn)一步研究。

解淀粉芽孢桿菌作為一種極具開發(fā)前景的生防菌，具有生長速度快，代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高，抑菌活性強(qiáng)，培養(yǎng)條件易掌握，對多種病害具有明顯防治效果等優(yōu)點(diǎn)[23]。本試驗(yàn)所得出的結(jié)論進(jìn)一步證明了解淀粉芽孢桿菌的生防潛力，也為該菌的生防開發(fā)與應(yīng)用提供了重要參考價值，為山茶灰斑病的生物防治提供堅實(shí)的理論依據(jù)，但目前有關(guān)解淀粉芽孢桿菌的拮抗機(jī)理、拮抗物質(zhì)(抗生素、抗菌脂肽類等)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的研究未見報道，有待于進(jìn)一步探究。

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BacillusamyloliquefaciensAntimicrobial Effect onPestalotiopsisguepini(Desm.) Stey/

Zhang Jing, Ran Xiaoxiao, Zhu Tianhui, Peng Yan, Liu Yang(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, P. R. China)//

1) 國家科技基礎(chǔ)條件平臺項(xiàng)目(2005DK21207-13)。

張靜，女，1990年4月生，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

朱天輝，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：zhuth1227@tom.com。

2013年10月23日。

S476.11

責(zé)任編輯：程 紅。