耐福美雙桑氏鏈霉菌生物型的選育1)

余 琴 朱天輝 李姝江 安曉龍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625000)

耐福美雙桑氏鏈霉菌生物型的選育1)

余 琴 朱天輝 李姝江 安曉龍

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，雅安，625000)

為選育抗藥性桑氏鏈霉菌(Streptomycessampsonii)，采用紫外線照射與藥物培養(yǎng)基馴化結(jié)合法，篩選出MV-1、MV-2、MV-3、MV-4、MV-5等5株能在含有200 mg/L福美雙的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的抗性突變株。結(jié)果顯示：出發(fā)原菌株KJ40對(duì)福美雙最敏感，EC50為12.82 mg/L，致死濃度為40 mg/L。5株突變株中，MV-2和MV-5的EC50值最高，為129.28 mg/L，抗性水平最高，達(dá)10.09；MV-1最低，EC50為100.13 mg/L，抗性水平7.81。通過(guò)抑菌效果測(cè)定發(fā)現(xiàn)，MV-2和MV-4對(duì)紫絲核菌(Rhizoctoniacrocorum)抑菌力顯著高于KJ40，抑菌率為80.39%和76.08%，分別比KJ40提高了10.59%和6.28%；MV-5無(wú)抑菌效果；MV-1和MV-3對(duì)病原菌的抑菌效果與KJ40無(wú)顯著差異。拮抗活性高于親本的MV-2和MV-4與福美雙協(xié)同使用，抑菌效果高于菌株和福美雙藥液?jiǎn)为?dú)使用。

桑氏鏈霉菌；抗福美雙；紫外線誘變

Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(7).-133～136，142

We screened out five mutation strains resistant to thiram of MV-1, MV-2, MV-3, MV-4 and MV-5 by the combination methods of UV irradiation and medical cultivation to select the thiram-resistant mutants ofStreptomycessampsonii. Among the tested strains ofStreptomycessampsonii, KJ40 was the most sensitive to thiram, the EC50was 12.82 μg/mL, the lethal concentration was 40 μg/mL. The resistant level of MV-2 and MV-5 were the highest between the thiram-resistant strains, and the EC50and the resistant level were 129.28 μg/mL and 10.09, respectively. The resistance level of MV-1 was the lowest, and the EC50and the resistant level were 100.13 μg/mL and 7.81, respectively. By determining inhibiting effect, inhibition activities of MV-2 and MV-4 were more significant than their parental strains, and the inhibition rate reached 80.39% and 76.08%, respectively. Compared with KJ40, the inhibition rates were improved by 10.59% and 6.28%, respectively. MV-5 had no antibacterial effect onRhizoctoniacrocorum. Compared with the parental strains, there were no significant changes in inhibition activities of mv-1 and mv-3. By using the mixed of Thiram and Thiram-resistant mutants with the strongest inhibition activity, the inhibiting effect was more than that of thiram-resistant mutantsor and thiram alone.

KeywordsStreptomycessampsonii; Thiram-resistant; Mutation by UV irradiation

隨著近代對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)度依賴，很多病原真菌對(duì)化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗藥性，更進(jìn)一步導(dǎo)致了化學(xué)農(nóng)藥的濫用，對(duì)全球的環(huán)境健康和食品安全構(gòu)成了巨大威脅。目前，應(yīng)用生物防治控制植物病害已經(jīng)越來(lái)越受到世界各國(guó)的重視，篩選有益微生物、由生防微生物開發(fā)的農(nóng)藥已成為國(guó)內(nèi)外生物防治研究的熱點(diǎn)。但能夠?qū)嶋H應(yīng)用到植物病害防治上的還很少。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室從楊樹根系分離得到了一株對(duì)楊樹紫絲核菌(Rhizoctoniacrocorum)有抑制作用的StreptomycessampsoniiKJ40[1]。國(guó)內(nèi)對(duì)桑氏鏈霉菌的研究較少，Jain等[2]從花園的土壤中分離得到具有抗真菌活性桑氏鏈霉菌菌株。野生鏈霉菌株對(duì)農(nóng)藥的抗藥性差，當(dāng)施用農(nóng)藥后對(duì)具生防作用的菌株也有殺滅效果，造成生防作用下降或者無(wú)明顯生防作用。報(bào)道顯示[3]，生防菌和化學(xué)農(nóng)藥混合使用，不僅可以降低農(nóng)藥的使用量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，還因?yàn)榛瘜W(xué)殺菌劑的使用削弱了病原菌的生長(zhǎng)，使其對(duì)生防菌更加敏感，從而提高了生防菌的防治效果。實(shí)現(xiàn)生防菌和化學(xué)農(nóng)藥綜合利用的前提是生防菌對(duì)化學(xué)農(nóng)藥要有一定的耐藥性。本研究采用紫外線照射與藥物培養(yǎng)基馴化相結(jié)合的方法，選育對(duì)福美雙具有抗性的桑氏鏈霉菌突變菌株，通過(guò)篩選獲得抗福美雙突變株，并對(duì)抗福美雙突變株的生防特性進(jìn)行了分析研究，為突變菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

桑氏鏈霉菌KJ40菌株(以下簡(jiǎn)稱鏈霉菌KJ40)和楊樹紫紋羽病病原菌紫絲核菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。40%福美雙可濕性粉劑購(gòu)自山東濰坊萬(wàn)盛生物農(nóng)藥有限公司。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于放線菌的培養(yǎng)，其配比為葡萄糖10 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、NaC 15 g、水1 L，pH=7.0～7.2。PDA培養(yǎng)基用于拮抗性測(cè)定，其配比為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L，pH自然。

福美雙對(duì)鏈霉菌孢子致死濃度的測(cè)定：鏈霉菌KJ40斜面25 ℃培養(yǎng)2 d，將其制備成106～107個(gè)/mL的孢子懸液。取1 mL制備好的出發(fā)菌株孢子懸液分別涂布于含福美雙1、5、10、50、100、200 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，以不加福美雙的處理為對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)。2 d后逐日觀察記載菌落的生長(zhǎng)情況。凡是在前一個(gè)低濃度平板上長(zhǎng)出菌落而在后一個(gè)較高濃度平板上未長(zhǎng)出菌落的，后一濃度即為福美雙對(duì)出發(fā)菌株孢子的致死濃度[4]。

紫外線誘變：將出發(fā)菌株接種于斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)活化2 d，將其制備成孢子懸液。取1 mL菌懸液按照梯度稀釋法[5]稀釋為10-3、10-4、10-5。吸取不同稀釋梯度的菌懸液分別涂布在平板上，于30 W紫外燈下誘變30 s。25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后計(jì)算菌落數(shù)，以未經(jīng)紫外線誘變菌株的涂布培養(yǎng)結(jié)果為對(duì)照，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算紫外誘變后的致死率，確定最佳的誘變菌懸稀釋液濃度。將確定的最佳誘變濃度菌懸液吸取1 mL涂布在平板上，30 W紫外燈下誘變10、20、30、60、120 s，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后計(jì)算菌落數(shù)。試驗(yàn)以不進(jìn)行紫外誘變的平板為對(duì)照，并以致死率在60%～90%[6]確定最佳誘變時(shí)間。

抗福美雙突變株的篩選：將突變株接入斜面進(jìn)行培養(yǎng)保存。再將得到的突變株平板劃線培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入斜面2～3 d，將其制備成孢子懸液。吸取1 mL制備好的孢子懸液分別涂布于含福美雙40 mg/L的培養(yǎng)基平板上，30 W紫外燈下誘變30 s，每處理重復(fù)3次，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后計(jì)算菌落數(shù)。3 d后逐日觀察記載菌落生長(zhǎng)情況。凡是在平板上長(zhǎng)出菌落的，即為抗福美雙40 mg/L的突變菌株。如此反復(fù)，逐步提高藥劑濃度直到在福美雙200 mg/L的長(zhǎng)出菌株。計(jì)算菌落數(shù)并將單菌落挑接于斜面上，25 ℃培養(yǎng)，待斜面孢子豐滿，置于冰箱中，4 ℃保存。

抗性突變株對(duì)福美雙的抗性水平測(cè)定：將原KJ40菌株和5株突變株制成孢子懸液，取1 mL到含福美雙10、20、30、40、50、100、150、200 mg/L的牛肉膏蛋白胨平板上[7]，置于恒溫箱中，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。4 d后通過(guò)菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[8]，以不加福美雙的處理為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。通過(guò)抑菌率值和各有效藥劑濃度對(duì)數(shù)值之間的線性回歸分析[9]，求出各菌株的EC50值。以敏感菌株KJ40為對(duì)照?？剐酝蛔凅w的抗性水平=抗性突變體的EC50值/敏感菌株KJ40的EC50值。

抗福美雙突變株對(duì)楊樹紫絲核菌的抑菌效果：通過(guò)平板對(duì)峙法[6]測(cè)定出KJ40和突變菌株的抑菌效果。在直徑90 mm的PDA平板中心接種活化后的直徑5 mm的紫絲核菌，在PDA平板距中心25 mm對(duì)稱的4點(diǎn)接種直徑5 mm的KJ40和抗福美雙的突變菌株。25 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察記錄抑菌情況，測(cè)定抑菌帶寬度，3次重復(fù)。

福美雙和突變株協(xié)同對(duì)紫絲核菌的抑菌效果：將KJ40和突變菌株在福美雙50 mg/L PDA平板距中心25 mm對(duì)稱的兩側(cè)劃線培養(yǎng)。以不加福美雙藥液?jiǎn)为?dú)處理為對(duì)照。菌絲生長(zhǎng)抑制率=((對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑)×100%。式中，菌落直徑=測(cè)量菌落直徑-5.0。

抗性突變株的遺傳穩(wěn)定性：將經(jīng)過(guò)福美雙誘變獲得的具有抑菌作用的抗性突變株繼代轉(zhuǎn)管10次以上，再轉(zhuǎn)移至含200 mg/L福美雙的平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，2～3 d后觀察對(duì)福美雙抗性的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 福美雙對(duì)鏈霉菌孢子的致死濃度

由表1可知，福美雙對(duì)菌株KJ40孢子的致死濃度為40 mg/L，以此為菌株KJ40抗藥性致死突變標(biāo)志。將在40 mg/L長(zhǎng)出的5株耐藥菌株平板劃線培養(yǎng)后保存。

表1 福美雙對(duì)菌株KJ40孢子的致死濃度

2.2 紫外線誘變

2.2.1 最適菌體稀釋濃度

以菌株KJ40為出發(fā)菌株，對(duì)其不同濃度的菌懸液進(jìn)行30 W紫外燈下30 s誘變，誘變結(jié)果見表2。由表2可知，隨著菌懸液濃度的降低，致死率逐漸升高，由于高劑量可能造成更多負(fù)突變株，所以選擇致死率為60%～90%的劑量誘變。因此，確定最適的誘變菌懸液稀釋濃度為10-3。

表2 不同稀釋濃度菌懸液的紫外線誘變結(jié)果

2.2.2 最適誘變時(shí)間

以菌懸液稀釋濃度10-3為最適誘變濃度，進(jìn)行30 W紫外燈下不同時(shí)間誘變，誘變時(shí)間與菌落數(shù)變化關(guān)系如表3所示。由表3可知，隨著誘變時(shí)間的增長(zhǎng)，存活菌落數(shù)逐漸減少，致死率逐漸增加，依據(jù)致死率為60%～90%，確定最適誘變時(shí)間為30 s，此時(shí)致死率為85.38%。

表3 紫外線誘變時(shí)間對(duì)菌懸液的影響

2.3 抗福美雙突變株的篩選

通過(guò)紫外線誘變與藥劑馴化相結(jié)合的方法對(duì)親本桑氏鏈霉菌菌株KJ40進(jìn)行反復(fù)誘導(dǎo)，最終得到5個(gè)能在福美雙質(zhì)量濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并產(chǎn)孢的突變菌株(圖1)。突變株外部形態(tài)無(wú)較大變化，但在含藥平板上菌落數(shù)變少且生長(zhǎng)速度變緩，4d后才開始生長(zhǎng)。將篩選出的突變株命名為ΜV-1、ΜV-2、ΜV-3、ΜV-4、ΜV-5，在含藥200 mg/L平板上分別生長(zhǎng)出菌落數(shù)為46.67±7.50、380.67±89.37、213.67±24.58、10.00±8.02、211.00±12.53，KJ40無(wú)菌落生長(zhǎng)。

1.KJ40；2.MV-3；3.KJ40的孢子，×400；4.MV-3的孢子，×400；5.MV-2的孢子，×400；6.MV-4的孢子，×400。

圖1 福美雙200 mg/L質(zhì)量濃度下菌株生長(zhǎng)情況

2.3.1 突變株對(duì)福美雙的抗性水平

將KJ40和突變株對(duì)福美雙進(jìn)行抗性水平測(cè)定。結(jié)果表明(表4)，KJ40的EC50值為12.82 mg/L，和抗福美雙突變株的EC50值存在顯著差異。在抗性突變株中，MV-2和MV-5的EC50值最大，為129.28 mg/L，其次是MV-3，EC50為124.50 mg/L。MV-1的EC50值最小，為100.13 mg/L。以親本KJ40菌株為敏感對(duì)照菌株，以各抗性突變株的EC50值與親本對(duì)照菌株的EC50值之比計(jì)算了各抗福美雙突變株的抗性水平。結(jié)果顯示，MV-2和MV-5的抗性水平最高，達(dá)到10.09，其次是MV-3，抗性水平為9.71，抗性水平最低的是MV-1，抗性水平為7.81。

表4 桑式鏈霉菌不同突變株對(duì)福美雙的抗性水平

注：采用Duncan多重比較法分析，同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05，n=3)。

2.3.2 突變株對(duì)楊樹紫絲核菌的抑菌效果

通過(guò)紫外線誘變和藥劑馴化后，拮抗菌對(duì)楊樹紫紋羽病菌的拮抗效果發(fā)生顯著變化(表5)。有的突變株拮抗活性減弱，如ΜV-5，對(duì)楊樹紫紋羽病菌無(wú)抑制效果；有的突變株對(duì)菌絲的拮抗活性無(wú)顯著變化，如ΜV-1和ΜV-3。有的突變株拮抗活性增強(qiáng)，如ΜV-2的抑菌率80.39%與KJ40的69.80%相比，提高了10.59%；MV-4提高了6.28%，提高了抑菌效果。選擇防效最好的MV-2、MV-4突變株研究其與福美雙對(duì)紫絲核菌的協(xié)同作用。

表5 抗藥性桑氏鏈霉菌對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑制效果

注：病原菌菌落直徑數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Duncan多重比較法分析，同一列不同字母表示差異顯著(P<0.05，n=3)。

福美雙和MV-2、MV-4協(xié)同對(duì)紫絲核菌的抑菌效果見圖2。親本KJ40無(wú)法在福美雙50 mg/L平板上生長(zhǎng)。紫絲核菌在50 mg/L含藥平板上基本無(wú)法拓展生長(zhǎng)(圖2e)。在MV-2、MV-4和福美雙協(xié)同作用時(shí)，紫絲核菌無(wú)法生長(zhǎng)(圖2f和圖2g)。結(jié)果表明，福美雙和鏈霉菌協(xié)同使用對(duì)紫絲核菌的抑菌作用與單獨(dú)使用鏈霉菌和福美雙藥液有明顯提高。

a.楊樹紫紋羽病菌在不含藥平板上的生長(zhǎng)情況；b.KJ40對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑菌效果；c.MV-4對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑菌效果；d.MV-2對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑菌效果；e.楊樹紫紋羽病菌在50 mg/L含藥平板上的生長(zhǎng)情況；f.MV-4在50 mg/L含藥平板上對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑制效果；g.MV-2在50 mg/L含藥平板上對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑制效果。

圖2 不同菌株對(duì)楊樹紫紋羽病菌的抑菌情況

2.3.3 突變株的遺傳穩(wěn)定性

將經(jīng)過(guò)福美雙誘變獲得的抗性突變株繼代轉(zhuǎn)管10次以上，再轉(zhuǎn)移至含福美雙50、100、150、200 mg/L的平板上，突變株菌落均能夠生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，且對(duì)病原菌的抑制效果不變。這說(shuō)明突變株的抗藥性和拮抗性較為穩(wěn)定和持久。

3 結(jié)論與討論

由于各種誘變劑對(duì)微生物的作用位點(diǎn)和方式不盡相同，因此，反復(fù)使用同一誘變因子會(huì)出現(xiàn)鈍化現(xiàn)象，可能引起微生物的回復(fù)突變。在鏈霉菌的誘變育種上，采用兩種或兩種以上的方式進(jìn)行誘變育種已經(jīng)取得了很好的效果[10-12]。本試驗(yàn)通過(guò)紫外線誘變和含藥培養(yǎng)基馴化相結(jié)合的方法，具有一定的方向性(抗藥性)，篩選出對(duì)福美雙高抗的突變性菌株。通過(guò)親本KJ40菌株和突變菌株做抗性水平測(cè)定，KJ40的致死濃度為40 mg/L福美雙藥液，EC50值為12.82 mg/L；各突變株能在200 mg/L上長(zhǎng)出菌落，EC50值100.13～128.28 mg/L，突變株對(duì)KJ40抗性水平為7.81～10.09，其中抗性水平最高的為MV-2和MV-5達(dá)到了10.09。說(shuō)明通過(guò)紫外線誘變和含藥培養(yǎng)基馴化相結(jié)合的方法可以明顯提高鏈霉菌的抗藥性。繼代轉(zhuǎn)管10次以上，再轉(zhuǎn)移至含藥平板上，突變株菌落均能夠生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，且對(duì)病原菌的抑制效果不變。這說(shuō)明突變株的抗藥性和拮抗性較為穩(wěn)定和持久。

絕大多數(shù)的高產(chǎn)抗生素產(chǎn)生菌都使用過(guò)紫外線誘變育種，且有很好的效果[13-15]。但對(duì)拮抗菌生物活性的影響卻是隨機(jī)的，有的抑制作用增強(qiáng)，有的抑制作用減弱甚至沒(méi)有抑制作用。如ΜV-2與KJ40的抑菌率相比，提高了10.59%，MV-5無(wú)抑菌效果。

實(shí)現(xiàn)生防菌和化學(xué)農(nóng)藥綜合利用的前提是生防菌對(duì)化學(xué)農(nóng)藥要有一定的耐藥性。本試驗(yàn)篩選出突變株ΜV-2、ΜV-4對(duì)福美雙具有高抗性且對(duì)病原菌的抑制作用有所提高；福美雙和鏈霉菌協(xié)同使用對(duì)紫絲核菌的抑菌作用與單獨(dú)使用鏈霉菌和福美雙藥液有明顯提高。有效降低了放線菌對(duì)化學(xué)藥劑的敏感性、增大了放線菌的生防潛能，使生防放線菌與殺菌劑協(xié)同效應(yīng)在綜合防治體系中的應(yīng)用成為可能。

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Mutation Breeding of Thiram-Resistant MutantsStreptomycessampsonii/

Yu Qin, Zhu Tianhui, Li Shujiang, An Xiaolong(Sichuan Agricultural University, Ya’an 625000, P. R. China)//

余琴，女，1988年9月生，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

朱天輝，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：zhuth1227@tom.com。

2013年10月27日。

S718.8

1) 四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(003z1100)。

責(zé)任編輯：程 紅。