粟米米糠水溶性蛋白的提取工藝優(yōu)化

李新華，馬 博，錢丹丹，白宏琦

（沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院，遼寧沈陽 110866）

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粟米米糠 北票永豐雜糧食品有限公司；氫氧化鈉、氯化氫、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸 均為分析純，頂國化學試劑有限公司。

XA-1型固體樣品粉碎機 河南省鞏義市光壓儀器廠；pH-3C型酸度計 上海雷磁儀器廠；SHZIIIB型循環(huán)水真空泵 上海華琦科學儀器有限公司；TDL-5000B型離心機 上海安亭科學儀器廠；JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗器 山東濟寧奧波超聲電氣有限公司；DZF6050型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取率的測定 蛋白質(zhì)含量的測定：半微量凱氏定氮法。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取工藝流程 5g粟米米糠→粉碎機→過篩（60目）→水料比（10∶1）→5%NaOH調(diào)pH10→恒溫（45℃）水浴超聲波振蕩1.5h→5000r/min離心10min→取上清液抽濾→5%HCl調(diào)pH3.5→4000r/min離心15min→真空干燥。

1.2.3 單因素實驗設計 參照谷糠、大米米糠蛋白提取工藝，再結合粟米米糠蛋白提取的實際操作，選取影響蛋白質(zhì)提取率的幾個關鍵因素設計單因素實驗[5]。

1.2.3.1 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響 在pH10，45℃，水料比10∶1的條件下，考察不同提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.2 pH對蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取時間1.5h，45℃，水料比10∶1的條件下，考察不同提取pH（8、9、10、11、12）對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.3 水料比對蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取時間1.5h，45℃，pH10的條件下，考察不同水料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1）對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.3.4 溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取時間1.5h，水料比10∶1，pH10的條件下，考察不同提取溫度（25、35、45、55、65℃）對蛋白質(zhì)提取率的影響。

Relationship between the precipitation during the Jiangnan rainy seasons(JRS) and the preceding heat content

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理，由于提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響范圍很小所以舍去，僅選取提取溫度（X1），pH（X2），水料比（X3）為自變量，以粟米米糠蛋白提取率為響應值（Y），設計三因素三水平的響應面分析實驗[6]，實驗因素和水平見表1。

表1 響應面分析實驗設計表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert8.0軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設計，再將所得的數(shù)據(jù)進行方差分析，建立回歸模型，響應面分析，優(yōu)化提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

圖1 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of corn bran protein using alkali extraction metho

2.1.1 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖1所示，隨著時間的延長，蛋白質(zhì)提取率逐漸遞增，蛋白質(zhì)提取率變化范圍從74.2%～80.1%不大。在1.5h以后，蛋白質(zhì)提取率遞增速度減緩逐漸趨于平穩(wěn)。反應時間過長反而會增加提取成本，降低勞動效率，而且還會影響提取蛋白質(zhì)的品質(zhì)，所以最佳提取時間確定為1.5h。

2.1.2 pH對蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖2所示，在pH8～10，隨著pH的升高，蛋白質(zhì)提取率呈遞增趨勢；在pH10時，蛋白質(zhì)提取率達到最大；在pH10以后，隨著堿濃度繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率呈遞減趨勢；由于強堿條件下粟米米糠蛋白中會發(fā)生一些不良反應，如蛋白質(zhì)水解和變性，美拉德反應加速，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)，提取物中非蛋白質(zhì)含量增加，純度降低[7]，從而使蛋白質(zhì)提取率下降，所以最佳的提取pH確定為10。

圖2 pH對粟米米糠蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pH on extraction rate of corn bran protein using alkali extraction method

2.1.3 水料比對蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖3所示，隨著水料比的不斷增大，蛋白質(zhì)提取率整體呈上升趨勢。在水料比6∶1～10∶1時，蛋白質(zhì)提取率遞增明顯。由于粟米米糠中含有一定量的膳食纖維和淀粉，具有較強的吸水膨脹能力，水料比過低時，物料會變得粘稠，流動性差，難于攪拌，升高水料比可以提高蛋白質(zhì)提取率[8]；在水料比10∶1以后，蛋白質(zhì)提取率遞增緩慢逐漸趨于平穩(wěn)，這時水和堿的用量也會隨水料比的增大而增加，這樣會增加提取成本，所以最佳的提取水料比確定為10∶1。

圖3 水料比對粟米米糠蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of corn bran protein using alkali extraction method

2.1.4 溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響 如圖4所示，在溫度25～45℃時，隨溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率呈遞增趨勢；在45℃時，蛋白質(zhì)提取率達到最大；在溫度45℃以后，隨著溫度持續(xù)升高，蛋白質(zhì)提取率明顯下降。這是因為當溫度較低時，水分子與蛋白質(zhì)分子間相互作用較小，溫度適當增加，蛋白質(zhì)分子的構象發(fā)生改變，分子立體結構伸展，有利于蛋白分子與水分子的運動及相互作用，此時溫度起到增溶的作用[9-10]。溫度繼續(xù)升高，使蛋白質(zhì)空間構相某些弱鍵斷裂，破壞了肽鍵的特定結構，使得原來在分子內(nèi)部的一些非極性基團暴露在分子表面，因而降低了蛋白質(zhì)的溶解度，促使蛋白質(zhì)分子之間的相互結合而凝結沉淀[11]，所以最佳的提取溫度確定為45℃。

圖4 提取溫度對粟米米糠蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of corn bran protein using enzymatic hydrolysis method

2.2 響應面優(yōu)化提取工藝

2.2.1 實驗設計及結果 根據(jù)單因素實驗分析，進行Box-Behnken中心組合實驗設計，共17個實驗，其中12個析因實驗，5個中心實驗。中心點重復實驗用來估計實驗誤差。采用Design-Expert 8.0軟件對所得的數(shù)據(jù)進行實驗設計與分析[12]，結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results for response surface analysis

2.2.2 響應面模型的建立 采用Design-Expert 8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得出粟米米糠蛋白提取率（Y）的回歸方程如下：Y=78.50+0.54X1-0.56X2+3.37X3-0.025X1X2-0.050X1X3+0.35X2X3-1.79X12-3.49X22-3.51X32

回歸方程中各因素響應值的顯著性由F值來判定，p值越小，顯著性越高。對回歸方程做顯著性檢驗與方差分析[13]，結果見表3。

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

從表3結果可知，模型p＜0.0001極顯著，同時模型失擬項p=0.0607不顯著，說明模型成立且誤差小，模型的決定系數(shù)R2=0.9864，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9688，說明該模型能解釋96.88%響應值的變化，僅有總變異的3.12%不能用此模型來解釋，綜上所述該模型擬合程度良好，可以用此模型分析堿法提取工藝參數(shù)[14]；回歸方程的一次項中各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響為水料比（X3）極顯著、pH（X2）顯著、提取溫度（X1）不顯著，二次項對其影響均極顯著，交互項對其影響均不顯著，說明響應值的變化相當復雜，實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系；各因素的F值可以反映出各因素對蛋白質(zhì)提取率影響的重要性，F(xiàn)值越大，表明因素影響越大[15]，所以各因素對蛋白提取率影響的大小順序為：水料比（X3）＞pH（X2）＞提取溫度（X1）。

2.2.3 響應曲面 根據(jù)回歸方程，做出響應曲面，考察擬合響應曲面的形狀，分析提取溫度（X1），pH（X2），水料比（X3）對粟米米糠蛋白提取率的影響，如圖5～圖7所示，隨著每個因素的增大，響應值增大，當響應值增大到極值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減小[16]。比較圖5～圖7可知，水料比（X3）對蛋白質(zhì)提取率的影響最為顯著；而提取pH（X2）、提取溫度（X1）次之；在交互項對蛋白質(zhì)提取率的影響中，提取pH與水料比（X2X3）的交互作用對蛋白質(zhì)提取率的影響最大，提取溫度與水料比（X1X3）次之，提取溫度與提取pH（X1X2）最小。

圖5 Y=f（X1，X2）的響應面Fig.5Responsive surfaces of Y=f（X1，X2）

圖6 Y=f（X1，X3）的響應面Fig.6Responsive surfaces of Y=f（X1，X2）

圖7 Y=f（X2，X3）的響應面Fig.7Responsive surfaces of Y=f（X2，X3）

2.2.4 工藝優(yōu)化 為進一步確定最佳提取條件，利用Design-Expert 8.0軟件對提取工藝進行優(yōu)化，得到的堿法提取粟米米糠蛋白的最佳條件是：提取溫度46.44℃，pH9.94，水料比10.95∶1，提取時間1.5h，在此工藝條件下，粟米米糠蛋白提取率的預測值是79.36%。為了方便實際操作，將工藝參數(shù)調(diào)整為：提取溫度46℃，pH10，水料比11∶1，提取時間1.5h，將此條件參數(shù)代入回歸方程得到的新預測值為79.34%，在此條件下進行三組平行實驗，實際測得粟米米糠蛋白提取率為79.15%，與預測值僅相差0.19個百分點，稍低于實驗設計值，但接近于最優(yōu)提取條件的預測值，所以實驗值與預測值相符合[17]，說明調(diào)整后的工藝參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

3 結論

利用堿溶酸沉法對粟米米糠進行蛋白質(zhì)提取，提取率高，操作簡單，成本較低，可以推廣至工廠化生產(chǎn)；Box-Behnken中心組合實驗設計建立了堿法粟米米糠蛋白提取工藝參數(shù)的二次回歸模型，經(jīng)驗證該模型誤差小，擬合程度好，合理可靠，能夠較好地預測粟米米糠蛋白的提取率。通過對方差、響應曲面、二次回歸方程的分析得到，各因素對粟米米糠蛋白提取率影響程度為：水料比＞提取pH＞提取溫度；兩因素交互作用對蛋白質(zhì)提取率的影響程度為：提取pH與水料比＞提取溫度與水料比＞提取溫度與提取pH；提取最佳條件為：提取時間1.5h、提取pH10、提取溫度46℃、水料比11∶1，蛋白質(zhì)提取率實際測得79.15%，達到了優(yōu)化的目的。

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