蘋果酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝研究

于麗穎，成樂琴

（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

大豆異黃酮的健康功效多種多樣，可以預(yù)防多種疾病和改善骨健康狀況[1]。大豆中天然存在的異黃酮包括大豆異黃酮糖苷和大豆異黃酮苷元兩類，其中，大豆異黃酮糖苷占到了總異黃酮含量的80%～95%以上，糖苷型大豆異黃酮由于分子較大，食用后不能被人體直接吸收，一般是在體內(nèi)消化酶作用下轉(zhuǎn)化為苷元被人體吸收，但目前保健品大豆異黃酮各種類型主要成分是糖苷，資料顯示[2-4]，體內(nèi)消化酶一般水解率在20%～40%，產(chǎn)品功效較低。另外，每個(gè)人腸道消化酶不太一樣，也就是說，因人而異，即使食用同樣的大豆異黃酮，效果相差也會很大。因此體外水解工藝開發(fā)就具有實(shí)際意義。目前，大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化苷元的方法[5-9]最常用的是酸催化法、堿催化法、酶催化法。酸水解通常用鹽酸、硫酸作催化劑，強(qiáng)酸條件下水解同時(shí)對大豆異黃酮苷元的穩(wěn)定性有所影響。堿催化產(chǎn)物苷元容易降解，應(yīng)用受到很大限制。酶水解法具有水解條件溫和、產(chǎn)物穩(wěn)定性好、純度高等特點(diǎn)，但酶生產(chǎn)成本很高，而且酶不容易重復(fù)利用，需要進(jìn)一步研究低成本的酶固化技術(shù)。用蘋果酸做催化劑來催化大豆異黃酮糖苷的水解，避免目前工業(yè)上的水解方法對設(shè)備的腐蝕，水解產(chǎn)物無需分離直接用于功能性食品，彌補(bǔ)了現(xiàn)有大豆異黃酮轉(zhuǎn)化苷元工藝中選用鹽酸催化、堿催化和酶催化等技術(shù)缺陷，因此是一條應(yīng)用價(jià)值較高的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆異黃酮糖苷標(biāo)樣 大豆苷，黃豆黃苷、染料木苷，大豆苷元，黃豆黃素，染料木素，含量超過98%，購天津馬克生物有限公司；糖苷型大豆異黃酮提取物 含量為91.3%，購西安金綠生物工程公司。

高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司；分析天平 北京醫(yī)用天平廠；CS101-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；KQ-250VDE型雙頻數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

稱取大豆異黃酮糖苷50mg置于50mL圓底燒瓶中，加入一定濃度蘋果酸水溶液10mL，超聲水浴1h，超聲頻率45kHz，水浴溫度75℃。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到高壓釜中，反應(yīng)溫度為110～130℃，反應(yīng)時(shí)間為0.5～2h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液到室溫。將冷卻后具有部分析出的反應(yīng)液用5mL甲醇全部溶解后，取一定量反應(yīng)液用甲醇稀釋到100μg/mL，過0.45μm濾膜后上機(jī)測其糖苷的含量，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定最佳水解條件。

1.3 糖苷及其苷元含量的測定

色譜條件：色譜柱：Shimadzu VP-ODS C18柱，150mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相A：0.4%磷酸水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序：0～10min，30%～35%B；10～20min，35%～40%B；20～30min，40%～55%B；30～40min，55%～65%B。流速：1mL/min；檢測波長為：260nm，測定溫度為30℃；進(jìn)樣量：20μL。

根據(jù)糖苷和苷元化學(xué)性質(zhì)的不同，從色譜柱中流出的先后順序不同，經(jīng)紫外檢測器測定，通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較，以保留時(shí)間定性、峰面積定量、外標(biāo)法計(jì)算。

大豆異黃酮糖苷水解率（%）=水解前后大豆異黃酮糖苷含量之差/水解前大豆異黃酮糖苷含量×100

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 水解溫度的選擇 實(shí)驗(yàn)分別選擇110、115、120、125、130℃為水解溫度，在蘋果酸溶液濃度為2.0mol/L，水解時(shí)間2.5h的條件下水解，按照1.2的步驟操作，計(jì)算大豆異黃酮糖苷水解率。

1.4.2 蘋果酸水溶液濃度的選擇 實(shí)驗(yàn)分別選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mol/L的蘋果酸水溶液為催化劑，水解溫度125℃，水解時(shí)間2.5h的條件下水解，按照1.2的步驟操作，計(jì)算大豆異黃酮糖苷水解率。

1.4.3 水解時(shí)間的選擇 實(shí)驗(yàn)分別選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5h為水解時(shí)間，在蘋果酸水溶液濃度為2.0mol/L，水解溫度125℃的條件下水解，按照1.2的步驟操作，計(jì)算大豆異黃酮糖苷水解率。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)方法，優(yōu)化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝。以水解率為考察指標(biāo)，選擇反應(yīng)溫度（120、125、130℃）、反應(yīng)時(shí)間（2.0、2.5、3.0h）、蘋果酸濃度（1.5、2.0、2.5mol/L）作為考察因素，按三因素三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（43），見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor level table of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同反應(yīng)溫度對大豆異黃酮水解率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同反應(yīng)溫度對水解率的影響Fig.1 Effect of different reaction temperature on hydrolysis rate

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度增加，水解率逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)溫度為125℃，水解率達(dá)到90.4%，一般大豆異黃酮糖苷在人體消化酶作用下，水解率為20%左右，大豆異黃酮糖苷水解率達(dá)到90%更具有實(shí)際意義。因此，在單因素水解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，適宜溫度為125℃。為了進(jìn)一步考察反應(yīng)溫度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應(yīng)溫度分別為120、125、130℃進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 不同蘋果酸水溶液濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同催化劑蘋果酸水溶液濃度對水解率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of catalyst malic acid on hydrolysis rate

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨催化劑蘋果酸水溶液濃度的增加，水解率逐漸增加，然后降低；當(dāng)蘋果酸濃度為2.0mol/L時(shí)，水解率為90.4%，再增加酸濃度，水解率有所降低，可能的原因，蘋果酸為有機(jī)弱酸，適宜的濃度酸性較強(qiáng)，濃度過大會抑制其電離，從而減弱酸性，所以適宜的蘋果酸濃度為2.0mol/L。為了進(jìn)一步考察催化劑濃度對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇蘋果酸濃度分別為1.5、2.0、2.5mol/L進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 不同反應(yīng)時(shí)間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨反應(yīng)時(shí)間增加，水解率也逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.5h，水解率達(dá)到90.4%，延長時(shí)間，水解率變化不大。為了進(jìn)一步考察反應(yīng)時(shí)間對大豆異黃酮糖苷水解率的影響，選擇反應(yīng)時(shí)間時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0h進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對水解率的影響Fig.3 Effect of different reaction time on hydrolysis rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)確立優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 The result analysis of orthogonal experiment

根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行方差分析見表3[10]。

表3 蘋果酸水解正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 3 The variance analysis of orthogonal experiment in the malic acid hydrolysis

從表2的極差分析結(jié)果可知，三因素對水解率的影響程度依次為A＞B＞C，三因素的最佳水平組合為A3B3C2，即蘋果酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的最佳工藝條件為：反應(yīng)溫度130℃，反應(yīng)時(shí)間為3.0h，蘋果酸水溶液濃度為2.0mol/L，水解率達(dá)到94.0%以上。表3的方差分析結(jié)果表明，水解溫度和水解時(shí)間對大豆異黃酮糖苷的水解效果具有顯著影響。

2.2.2 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，按該工藝條件重復(fù)提取3次，測得大豆異黃酮糖苷的水解率分別為94.8%、95.1%、94.2%，平均為94.7%，表明本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可靠。

大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品、原料及水解后樣品的液相色譜分析圖見圖4。

圖4 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品、原料及水解后樣品的液相色譜分析圖Fig.4 Liquid chromatographic analysis of soybean isoflavones standard,raw material and hydrolysis sample

由圖4液相色譜分析結(jié)果表明，根據(jù)保留時(shí)間，對應(yīng)A和B，水解產(chǎn)物C中峰1和峰3信號基本消失，峰2僅有微弱的信號峰，與此同時(shí)，峰4～峰6相應(yīng)增加，說明蘋果酸對大豆異黃酮糖苷顯示出較強(qiáng)的水解能力。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蘋果酸催化大豆異黃酮糖苷水解苷元的工藝條件，以大豆異黃酮糖苷的水解率作為評價(jià)指標(biāo)，得出各因素對水解效果影響的主次順序依次為反應(yīng)溫度＞反應(yīng)時(shí)間＞蘋果酸水溶液濃度。通過極差分析可知，反應(yīng)溫度對水解率影響顯著。大豆異黃酮糖苷水解的最佳工藝條件為反應(yīng)溫度130℃，反應(yīng)時(shí)間3.0h，催化劑蘋果酸水溶液濃度2.0mol/L，在此條件下所得的大豆異黃酮糖苷水解率達(dá)到94.7%，達(dá)到和超過目前一般文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)大豆異黃酮糖苷水解率。

本課題成功地探索出了一條簡便、清潔、成本較低，水解產(chǎn)物無需后處理直接用于功能性食品的綠色合成工藝路線，彌補(bǔ)了現(xiàn)有工藝中的技術(shù)缺陷，因此實(shí)用性較高。

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