雙水相純化淀粉糖化酶的影響因素研究

霍丹群，汪治宏，郭明遺，宋春霞，肖亞若，沈才洪，周 軍，曾 娜，侯長軍

（1.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶 400044；2.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000）

葡糖糖淀粉酶是我國最大、最重要的酶制劑產(chǎn)品之一[1]。產(chǎn)葡糖淀粉酶的菌株多有報(bào)道，如紅曲霉[2]、黑曲霉[3]、米根霉[4]等。從菌株的發(fā)酵液中分離酶液的方法主要有鹽析法，等電點(diǎn)沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法。但是這些方法在分離過程中容易發(fā)生蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致蛋白分離提取的收率和效率相對較低[5]。

雙水相萃取技術(shù)克服了以上缺點(diǎn)[6]，雙水相的形成是一種聚合物與一種鹽在適當(dāng)?shù)臐舛认禄旌嫌谒托纬伞盎ゲ挥H和”的雙水相體系，提取酶是根據(jù)蛋白質(zhì)的鹽溶及靜電作用等因素分離出目標(biāo)蛋白酶。PEG是一類具有良好親水性和生物兼容性的高分子聚合物，廣泛用于生物領(lǐng)域[7]。PEG的雙水相體系萃取技術(shù)也逐漸被人們重視和使用[6，8-10]。分離物質(zhì)在雙水相體系中液-液相平衡模型理論時(shí)有報(bào)道。Khadijeh Khederlou等考察了頭孢氨芐在PEG4000和PEG10000與K2HPO4、檸檬酸鈉的雙水相中的分配額度[11]。Shahla Shahriari等研究了β-淀粉酶和淀粉轉(zhuǎn)葡糖苷酶在PEG/磷酸鹽中的分配性能，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)其分配形為與Flory-Huggins晶格模型相符[12]。Mona Mirsiaghi等研究了L-精氨酸鹽在PEG雙水相體系的分配性能，結(jié)果表明，鹽的濃度影響較大，溫度次之[13]。用PEG提取淀粉糖化酶的方法也相繼被探索[14]。

但是對于不同菌株的發(fā)酵酶液進(jìn)行不同條件的探索的區(qū)分力度不夠。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建不同分子量的PEG與不同的鹽形成的雙水相系統(tǒng)，用于分離、提純四種不同菌體的淀粉糖化酶發(fā)酵液。不同的菌體發(fā)酵液中淀粉糖化酶和雜蛋白的含量均不同，所以有針對性的構(gòu)建適用于不同體系的雙水相系統(tǒng)具有十分重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米根霉、根霉、酒精酵母和酯化酵母 由瀘州釀酒研究所提供；標(biāo)準(zhǔn)淀粉糖化酶（活力十萬個(gè)單位）、聚乙二醇（分子量分別是600、800、1000、2000） 分析純，阿拉??；硫酸銨、硫酸鎂、磷酸氫二鈉 國產(chǎn)分析純；本次實(shí)驗(yàn)所用水 為去離子水。

UV-1100型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；AllegraX-22R型冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；HHS型水浴鍋 上海圣欣科學(xué)儀器有限公司；FD-2型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯汁200g，葡萄糖20.0g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，瓊脂20.0g，pH6.00；種子培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯汁200g，葡萄糖20.0g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 1.5g，pH6.00，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨60.0g，橄欖油20.0g，麥芽糖10.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO42.0g，pH6.00，搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200r/min。以上培養(yǎng)基均在121℃下滅菌21min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 純化工藝流程制作PEG1000/（NH4）2SO4相圖→培養(yǎng)四種不同的菌株→分別提取粗酶液→配制雙水相系統(tǒng)→將酶液與雙水相系統(tǒng)混合→漩渦振蕩→靜置分層→4℃冷凍離心，轉(zhuǎn)速1000r/min，時(shí)間2min→靜置分層→吸取上下層液體測定酶活值和蛋白質(zhì)含量→計(jì)算分配系數(shù)→獲得目標(biāo)酶液。

1.3.2 葡萄糖淀粉酶粗酶液的提取 低溫保存的菌株經(jīng)過平板活化后，接入液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)。按5%的接種量，將種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵不同時(shí)間后得到葡萄糖淀粉酶的發(fā)酵液[15]。將獲得的粗酶液用8層紗布過濾，除去大部分的菌絲體。濾液于4℃冷凍離心，轉(zhuǎn)速2000r/min，離心5min，分離上清液4℃貯存?zhèn)溆?。提取粗酶液后，為避免污染?yīng)盡快進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，同時(shí)在操作過程中應(yīng)該避免一些抑制酶活的金屬如Fe2+、Cu2+的加入[16]。

1.3.3 葡萄糖淀粉酶活性的測定方法 采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[17]稍作改進(jìn)，具體操作如下：稱取可溶性淀粉20g緩慢加入100mL沸水中，攪拌至液體澄清透明。待溶液冷卻后，用容量瓶定容至100mL。向50mL的比色管中加入25mL的可溶性淀粉溶液，調(diào)節(jié)pH至4.6，40℃水浴5min。加入1mL活力單位分別為4、8、12、16、20、24U/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖淀粉酶于比色管中。40℃水浴60min后加入200μL濃度為200g/L的NaOH溶液終止反應(yīng)，并立即冷卻。取冷卻后的溶液1mL置于另一比色管中，加入2mL的DNS溶液，沸水浴2min后冷卻，然后用蒸餾水于定容至25mL，在540nm處測定吸光值，用蒸餾水代替酶液為空白樣。

葡萄糖淀粉酶的活力單位：1mL酶液在40℃，pH4.6條件下，1h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位（U），以 U/mL表示。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測量 采用考馬斯亮藍(lán)法測量蛋白質(zhì)含量[18-20]，7支試管中，分別精確吸取0.1mg/mL的牛血清蛋白原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40mL，用蒸餾水稀釋至2.0mL，然后分別加入5.00mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，混合均勻，在595nm波長處比色測定，用2.0mL的蒸餾水代替蛋白溶液為空白樣。

1.3.5 PEG1000/（NH4）2SO4相圖的制作[21-23]稱取2.0g PEG1000于50mL的離心管，加入6.0g的去離子水溶解PEG，加入適量硫酸銨，漩渦振蕩，使溶液由澄清變?yōu)闇啙?，出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象。記錄加入硫酸銨的量，加入1～2g的水，使溶液由渾濁變?yōu)槌吻澹涗浖尤胨闹亓?。再次加?.3～0.5g的硫酸銨，使溶液由澄清變?yōu)闇啙?，重?fù)上訴步驟，記錄每次加入硫酸銨和水的質(zhì)量，根據(jù)硫酸銨和PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)繪制相圖。

1.3.6 雙水相萃取方法 用1.3.3和1.3.4的方法測定四種粗酶液的比酶活值和蛋白質(zhì)含量。在15mL的離心管中配制雙水相體系，添加分子量為600、800、1000、2000的PEG為1.8g使PEG的濃度達(dá)到15%[24]。加入1.0～2.5g的NaH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4、pH均調(diào)節(jié)為4.6，準(zhǔn)確吸取2mL四種發(fā)酵酶液置于15mL的離心管中。漩渦振蕩，靜置分層。4℃冷凍離心，轉(zhuǎn)速1000r/min，離心2min，離心液靜置一段時(shí)間直到分層明顯。用移液器分別吸取上下層液體各1mL稀釋兩到三倍后測定葡萄糖淀粉酶的酶活和蛋白質(zhì)含量。計(jì)算分配系數(shù)K=下相比酶活/上相比酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外分光光度計(jì)測540nm處吸光度，繪制酶活-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以酶活為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=22.253x+1.6868（R2=0.9990），如圖1所示。

圖1 淀粉糖化酶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose amylase

紫外分光光度計(jì)在595nm處測吸光度，繪制蛋白質(zhì)-吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛋白質(zhì)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程y=0.3158x+0.004（R2=0.9968）。如圖2所示。

2.2 PEG1000/硫酸銨相圖

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein

以PEG的百分比為橫坐標(biāo)，以硫酸銨的百分比為縱坐標(biāo)，制出相圖如圖3所示。相圖的曲線能用冪函數(shù)較好的擬合y=45.224x-0.472，R2為0.9910。

圖3 硫酸銨與PEG1000的相圖Fig.3 The phase diagram of PEG and（NH4）2SO4

2.3 粗酶液的酶活及蛋白質(zhì)含量

米根霉、根霉、酒精酵母、酯化酵母粗酶液的酶活和蛋白質(zhì)測量結(jié)果如表1所示。從表1中可以得出，米根霉的蛋白質(zhì)含量最高，酯化酵母的比酶活最高。說明酯化酵母的淀粉糖化酶粗酶液中所含的雜蛋白相對較少，而米根霉的中雜蛋白相比其他三組偏多。取α=0.05，做顯著性分析，得到酶活、蛋白質(zhì)含量、比酶活的顯著性結(jié)果見表2～表4。其中p值均小于0.01，且F均比crit大，可以判斷四種發(fā)酵液的各參數(shù)存在顯著性差異。

表1 粗酶液的酶活和蛋白質(zhì)測量結(jié)果Table 1 The enzyme activity and protein of crude enzyme

2.4 不同分子量的PEG和鹽對分離系數(shù)的影響

針對四種不同的葡萄糖淀粉酶發(fā)酵液做四種分子量的PEG和三種鹽的單因素實(shí)驗(yàn)，得到它們對分離系數(shù)的影響見圖4。PEG為15%，鹽的添加量為剛好達(dá)到分層的克數(shù)，添加過多會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，而且會(huì)擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成[25]不同鹽的添加量有差異，硫酸銨的添加量在1.3～1.8g之間，硫酸鎂2.0～2.6g，磷酸二氫鈉達(dá)到2.7g以上。硫酸銨對根霉的分配系數(shù)為0.083，效果較好。硫酸銨和硫酸鎂對酒精酵母和酯化酵母的分離效果接近。硫酸鎂對米根霉的分離效果明顯，分配系數(shù)較優(yōu)都小于0.25，而對酒精酵母均大于0.3。PEG1000對四種酶液的分配系數(shù)都小于其他三組，說明PEG1000的分離效果最好。PEG1000對米根霉的分離系數(shù)最小達(dá)到0.082。

表2 酶活的顯著性分析Table 2 Significant analysis of enzyme activity

表3 蛋白質(zhì)含量的顯著性分析Table 3 Significant analysis of protein

表4 比酶活的顯著性分析Table 4 Significant analysis of enzyme activity

2.5 不同分子量的PEG和鹽對酶活穩(wěn)定性的影響

分別計(jì)算各組上相和下相的比酶活，得到PEG和鹽對比酶活的影響如圖5。圖5中可以明顯看出，米根霉和根霉的上下相的比酶活差距很大，而酒精酵母和酯化酵母則相對較小。說明米根霉和根霉的分離效果優(yōu)于酒精酵母和酯化酵母。米根霉的比酶活最高達(dá)到147.16U/mg，根霉的為187.54U/mg，酒精酵母和酯化酵母分別是133.25、247.5U/mg。雖然米根霉和根霉的分離效果優(yōu)于酵母，但是酯化酵母的粗酶液中的比酶活已經(jīng)在150U/mg以上，所以即使在分離效果一般的情況下，酯化酵母的比酶活仍然高出其他的酶液。

2.6 蛋白質(zhì)回收率對比

測量出酶液和純化之后的蛋白質(zhì)含量，得到蛋白質(zhì)回收率如圖6。從圖6可以看出，米根霉和根霉的蛋白質(zhì)含量均在0.28mg/mL以上，而酒精酵母和酯化酵母的蛋白質(zhì)含量平均在0.10mg/mL左右，米根霉、根霉和酒精酵母的蛋白質(zhì)回收率在70%～87%之間，而酯化酵母則在88%～96%。說明米根霉，根霉，酒精酵母中雜蛋白去除量較多，酯化酵母較少。即雜蛋白含量較少的回收率較高。

2.7 純化倍數(shù)

圖4 不同分子量的PEG和鹽對分離系數(shù)的影響Fig.4 The influence of different molecular weight of PEG and salts on the separation factor

測量粗酶液的比酶活和純化之后的上相比酶活得到純化倍數(shù)如圖7所示。PEG600和磷酸二氫鈉對酶液的純化效果相對較差。米根霉的純化倍數(shù)最高為3.35，鹽為硫酸鎂，PEG分子量為1000。根霉在硫酸銨為添加鹽的條件下PEG2000的純化倍數(shù)大于PEG1000的純化倍數(shù)0.4，而PEG2000的分離系數(shù)比PEG1000的分離系數(shù)僅僅大0.03。為了使酶的純度提高，所以根霉的最佳PEG的分子量選定為2000。通過以上實(shí)驗(yàn)，得到不同酶液的最優(yōu)提取參數(shù)如表5所示。

3 結(jié)論

圖5 不同分子量的PEG和鹽對比酶活的影響Fig.5 The influence of different molecular weight of PEG and salts on the specific activities

通過對米根霉、根霉、酒精酵母和酯化酵母的葡萄糖淀粉酶發(fā)酵液的單因素實(shí)驗(yàn)，得到米根霉的PEG分子量為1000，添加鹽為MgSO422.86%；根霉為PEG2000，鹽為（NH4）2SO414.37%；酒精酵母和酯化酵母的PEG均為1000，鹽為（NH4）2SO415.73%和（NH4）2SO413.33%。本方法對四種酶液的葡萄糖淀粉酶萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得的最優(yōu)工藝參數(shù)，能有效的減少工藝操作的工作量，為進(jìn)一步從有針對性的粗酶液中分離純化葡萄糖淀粉酶奠定基礎(chǔ)。

圖6 蛋白質(zhì)回收率Fig.6 Recovery of protein

圖7 純化倍數(shù)Fig.7 Purification fold

表5 各酶最優(yōu)工藝參數(shù)Table 5 The optimal process parameters

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