bFGF與ERK1/2阻斷劑對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)的影響

楊楠 康剛勁 董敏

bFGF與ERK1/2阻斷劑對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)的影響

楊楠 康剛勁 董敏

后發(fā)性白內(nèi)障；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；人晶狀體上皮細(xì)胞；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白； 胞外調(diào)節(jié)激酶ERK； ERK信號(hào)通路阻斷劑

目的觀察堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)阻斷劑PD98059對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells， HLEC)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)mRNA表達(dá)的影響。方法體外傳代及培養(yǎng)HLEC，加入10 μg·L-1bFGF及PD98059作用一定時(shí)間并根據(jù)作用時(shí)間進(jìn)行分組。MTT法檢測(cè)HLEC數(shù)量及存活率；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定HLEC中α-SMA mRNA 的表達(dá)。結(jié)果HLEC的存活率在bFGF作用組中隨時(shí)間增長(zhǎng)而增強(qiáng)，作用6 h時(shí)達(dá)126.34%，作用1 h組與作用6 h組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；只加PD98059組細(xì)胞存活率僅30.03%,與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。bFGF作用劑量不變的情況下，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加，作用1 h組與作用6 h組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；bFGF作用6 h后，α-SMA mRNA值達(dá)最高；加阻斷劑PD98059作用后，α-SMA mRNA表達(dá)減少且隨阻斷劑作用時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)進(jìn)一步減少，作用1 h組與作用6 h組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。結(jié)論bFGF對(duì)HLEC具有促增殖作用，在低濃度劑量不變的前提下，呈現(xiàn)時(shí)間相關(guān)性。bFGF可促進(jìn)HLEC分泌α-SMA，促進(jìn)HLEC分化，并呈現(xiàn)時(shí)間及劑量相關(guān)性。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(4)：326-329]

后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsule opacification,PCO)是白內(nèi)障術(shù)后主要并發(fā)癥之一,也是影響患者術(shù)后視力恢復(fù)的主要原因。多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子特別是早期堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast factor，bFGF)的釋放，術(shù)中殘留的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)及皮質(zhì)，細(xì)胞遷移、增殖及轉(zhuǎn)分化，細(xì)胞凋亡，血-房水屏障的破壞及IOL植入等因素共同作用促進(jìn)了PCO的形成[1-3]。PCO的組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障術(shù)后人LEC(HLEC)轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞，在這些細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)表達(dá)增強(qiáng)[3-6]。本研究以LEC為研究對(duì)象，用bFGF以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)阻斷劑PD98059作用不同時(shí)間，觀察LEC細(xì)胞中有無α-SMA形成。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑HLEC LSRA01/04(瀘州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；倒置顯微鏡及TS-2000A脫色搖床(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；-80 ℃超低溫冰箱(Thermo公司)；Centrifuge5415R低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；Mastercycler gradient PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；ND-100核酸蛋白檢測(cè)儀(德國(guó)Eppendorf公司)；無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)液培養(yǎng)基及胎牛血清、2.5 g·L-1胰蛋白酶消化液(美國(guó)Gibco公司)；bFGF液(美國(guó)R&D公司)及ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑PD98059(上海碧云天技術(shù)有限公司)均配制成10 μg·L-1濃度；總RNA提取試劑Trizol購自美國(guó)Invitrogen公司；噻唑(5-dimethy(thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、碘化乙啶、Cocktail片、二甲亞砜(DMSO)均購自美國(guó)Sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組HLEC LSRA01/04細(xì)胞株按照文獻(xiàn)中描述的方法[7]進(jìn)行復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng)。接種在96孔板、6孔板的細(xì)胞濃度為每孔50×103個(gè)細(xì)胞，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。培養(yǎng)48 h待細(xì)胞長(zhǎng)滿65%～80%可用于實(shí)驗(yàn)。3 d換液1次，達(dá)實(shí)驗(yàn)要求后進(jìn)行分組：對(duì)照組(未加任何試劑)；bFGF 1組：加入10 μg·L-1bFGF作用1 h；bFGF 2組：加入10 μg·L-1bFGF作用6 h；PD98059組：加入10 μg·L-1PD98059作用1 h；bFGF+PD98059 1組：加入10 μg·L-1bFGF作用1 h后加入10 μg·L-1PD98059作用1 h；bFGF+PD98059 2組：加入10 μg·L-1bFGF作用6 h后加入10 μg·L-1PD98059作用6 h。

1.3MTT法檢測(cè)HLEC細(xì)胞數(shù)量和存活率情況收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，按照每孔6000個(gè)細(xì)胞濃度接種于96孔板，和上述分組情況相同。每孔加入5 g·L-1MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔吸光度，存活率=(1-實(shí)驗(yàn)孔吸光度/對(duì)照孔吸光度)×100%,分析結(jié)果。

1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定HLEC中α-SMAmRNA的表達(dá)2.5 g·L-1胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌2次，細(xì)胞接種于6孔板，每孔均加入Trizol溶液10 μL,提取總RNA。檢測(cè)RNA濃度,將樣品稀釋50倍，引物用Primer3.0軟件設(shè)計(jì)：α-SMA上游；5’-GGGGGTGATGGTGGGAATG-3’,下游：5’-GCAGGGATGCTCTT-3’；β-actin基因引物上游：5’-GTGGACATCCGCAAAGA-3’,下游：5’-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3’。95 ℃、預(yù)變性90 s，94 ℃、變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，總共28個(gè)循環(huán)。72 ℃，延伸5 min。之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，放置于紫外線凝膠成像系統(tǒng)分析成像，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行照相。

2 結(jié)果

2.1倒置相差顯微鏡下觀察各組HLEC的形態(tài)學(xué)特征對(duì)照組的細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)，胞體無色透明(圖1)；bFGF 1組細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，可見較多的梭形細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，胞漿豐富(圖2)；bFGF 2組梭形細(xì)胞數(shù)量更多，幾乎滿視野，細(xì)胞看起來更加透亮，胞間出現(xiàn)長(zhǎng)的凸起相互連接生長(zhǎng)呈拉網(wǎng)狀(圖3)；PD98059組細(xì)胞狀況最差，細(xì)胞數(shù)量明顯降低，細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞基本呈圓球形，個(gè)別出現(xiàn)核固縮，未見梭形細(xì)胞，未見貼壁生長(zhǎng)，基本懸浮于培養(yǎng)液中(圖4)；bFGF+PD98059 1組，可見細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組減少，細(xì)胞基本貼壁生長(zhǎng)，胞體扁平，細(xì)胞核也較扁平，細(xì)胞透明度下降，胞內(nèi)可見大量致密顆粒，少量核固縮細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中(圖5)；bFGF+PD98059 2組，細(xì)胞數(shù)量，明顯少于對(duì)照組，細(xì)胞腫脹增大，漂浮的細(xì)胞增多(圖6)。

2.2bFGF及PD98059對(duì)各組HLEC存活率的影響HLEC的數(shù)量在加了bFGF時(shí)均增多，細(xì)胞活性增強(qiáng)，bFGF 1組細(xì)胞存活率達(dá)104.54%，bFGF 2組細(xì)胞存活率126.34%，作用時(shí)間較長(zhǎng)組，細(xì)胞數(shù)量多于作用短組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；只加bFGF組細(xì)胞數(shù)量明顯多于只加阻斷劑組，PD98059組細(xì)胞存活率僅30.03%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；bFGF+PD98059 1組細(xì)胞存活率為65.12%，bFGF+PD98059 2組細(xì)胞存活率為 62.33%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3bFGF通過ERK1/2信號(hào)通路對(duì)α-SMA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示，在bFGF作用劑量不變的情況下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，可見α-SMA mRNA表達(dá)明顯增加(6 h的表達(dá)量明顯多于1 h),呈時(shí)間相關(guān)性；在bFGF刺激1 h的情況下，加PD98059作用后α-SMA mRNA表達(dá)比未加組減少；在bFGF作用6 h后，α-SMA mRNA表達(dá)最高，加阻斷劑PD98059作用后，α-SMA mRNA表達(dá)減少，PD98059表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用(圖7)。

3 討論

PCO的形成與LEC密切相關(guān)，該細(xì)胞是單層立方上皮細(xì)胞，主要分布于晶狀體的前囊及赤道部，晶狀體的透明性與LEC的自身狀況和生長(zhǎng)情況緊密關(guān)聯(lián)。

3.1bFGF與PCO的關(guān)系目前公認(rèn)PCO的特點(diǎn)：(1)發(fā)生與年齡相關(guān)：年齡越小，發(fā)生率越高，兒童的發(fā)病率基本可以達(dá)100%。隨著年齡的增加,LEC表達(dá)bFGF基因以及合成bFGF的能力逐漸降低[7]。(2)細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是由白內(nèi)障術(shù)后晶狀體囊袋內(nèi)殘留的或新生的LEC在bFGF的作用下發(fā)生增殖、遷移和分化形成纖維膜引起。(3)PCO的組織病理學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)HLEC轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞并且可以在這些細(xì)胞中用免疫組織化學(xué)染色的方法見到表達(dá)較多的α-SMA[8-10]。

Figure 1 Morphological characteristic of HLEC in normal control group(×100) 正常對(duì)照組HLEC的形態(tài)學(xué)特征(×100)

Figure 2 Morphological characteristic of HLEC in bFGF 1 group(×100) bFGF 1組HLEC的形態(tài)學(xué)特征(×100)

Figure 3 Morphological characteristic of HLEC in bFGF 2 group(×100) bFGF 2組HLEC的形態(tài)學(xué)特征(×100)

本研究中，bFGF作用一段時(shí)間后HLEC有α-SMA分泌，并且在設(shè)定的6 h隨作用時(shí)間的增加逐漸增多。在只加PD98059時(shí)，α-SMA的分泌量最少。

Figure 4 Morphological characteristic of HLEC in PD98059 group(×200) PD98059組HLEC的形態(tài)學(xué)特征(×200)

Figure 5 Morphological characteristic of HLEC in bFGF+PD98059 1 group(×200) bFGF+PD98059 1組HLEC的形態(tài)學(xué)特征(×200)

Figure 6 Morphological characteristic of HLEC in bFGF+PD98059 2 group(×200) bFGF+PD98059 2組HLEC的形態(tài)學(xué)特征(×200)

3.2bFGF對(duì)HLEC具有促增殖作用，在低濃度劑量不變的前提下，呈時(shí)間相關(guān)性后囊膜混濁、PCO的發(fā)生與生長(zhǎng)因子的作用密切相關(guān)，bFGF對(duì)建立和維護(hù)正常晶狀體生理狀態(tài)極其重要，在正常人體環(huán)境中低劑量持續(xù)存在。FGF分為bFGF和aFGF,在LEC中發(fā)揮生物學(xué)效用的主要是bFGF，bFGF也稱為纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)， FGF型受體是酶偶聯(lián)受體，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生胞外刺激，激活相關(guān)酶產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。bFGF首先與胞膜上RTK結(jié)合可造成細(xì)胞膜上兩個(gè)相鄰的RTK的相互吸引從而形成二聚體，隨后發(fā)生磷酸化，進(jìn)一步激活Ras蛋白，開啟MAPK信號(hào)通路，啟動(dòng)促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控基因以及表達(dá)特定蛋白來影響細(xì)胞行為[11-13]。bFGF在正常眼內(nèi)組織中大量存在，只是表達(dá)量較低。已有文獻(xiàn)報(bào)道在不同濃度下，bFGF分別具有促增生、遷移和促分化作用。在bFGF維持在0．15 μg·L-1低濃度時(shí)，主要體現(xiàn)在促進(jìn)LEC增殖作用，10 μg·L-1時(shí)可以觀察到HLEC細(xì)胞增殖及有絲分裂等細(xì)胞活動(dòng)明顯；當(dāng)bFGF在高濃度范圍，達(dá)到了30 μg·L-1時(shí)，主要表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞移行等功能；bFGF達(dá)到40 μg·L-1時(shí)，還能發(fā)揮向纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化等作用。研究表明，在剛完成白內(nèi)障手術(shù)的動(dòng)物眼中檢測(cè)到bFGF的表達(dá)水平開始增高，可以誘導(dǎo)LEC增殖。

Figure 7 Gray analysis graph expression of α-SMA. 1: Normal control group; 2: bFGF 1 group; 3: bFGF 2 group; 4: PD98059 group; 5: bFGF+PD98059 1 group; 6: bFGF+PD98059 2 group α-SMA表達(dá)灰度分析圖。1:正常對(duì)照組；2：bFGF1組；3：bFGF2組；4：PD98059組；5：bFGF+ PD98059 1組；6：bFGF+ PD98059 2組

3.3bFGF及PD98059對(duì)HLEC表達(dá)α-SMA的影響FGF的信號(hào)分子可以有效激活促分裂原活化蛋白激酶家族，其中含量最豐富的是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK。在正常胞內(nèi)Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)途徑活化后均能促進(jìn)細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期[14]。PD 98059在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中都能特異性抑制MAPK激酶的活化,進(jìn)而抑制ERK1/2的磷酸化，進(jìn)一步阻斷該通路。作用機(jī)理主要是通過抑制活性酶的磷酸化來調(diào)控G0/G1期細(xì)胞[15],達(dá)到影響LEC的增殖及調(diào)控細(xì)胞周期的目的。

術(shù)后早期房水中的bFGF濃度明顯增高，促進(jìn)HLEC的增殖，同時(shí)對(duì)抗了TGF-β的促細(xì)胞凋亡作用。作用一段時(shí)間后，促進(jìn)正常細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生正常HLEC不能表達(dá)的物質(zhì)：大量α-SMA、纖維粘連蛋白以及I型及III型膠原等[3]。

PCO的預(yù)防一直是研究的熱點(diǎn)，從信號(hào)通路途徑及多種細(xì)胞因子入手研究其發(fā)生機(jī)制特別是術(shù)后早期的各種變化，對(duì)未來研究指出了一條新的思路。

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date：Dec 26,2013

Effects of bFGF and ERK1/2 blocking agent on α-SMA mRNA expression in human lens epithelial cells

YANG Nan,KANG Gang-Jin,DONG Min

posterior capsule opacification; basic fibroblast growth factor; human lens epithelial cells; alpha smooth muscle actin; extracellular regulated kinase; ERK signal pathway blocker

Objective To observe the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF)and extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2)blocking agent PD98059 on alpha smooth muscle actin (α-SMA)mRNA expression in human lens epithelial cells (HLEC).Methods HLEC were primarily cultured and passagedinvitro. The bFGF (10 μg·L-1)and PD98059 were added and activated for a certain period of time, and then divided according to the activated time. The number and activity of HLEC were detected by MTT, and RT-PCR was used to detect the expression of α-SMA mRNA in HLEC.Results The survival rate of HLEC in bFGF group increased with the time prolong, up to 126.34% at 6 hours, the difference was statistically significant between 1 hour and 6 hours (P<0.05); The cell survival rate in PD98059 group was only 30.03%, there was statistically significant difference compared with the control group (P<0.05). When the dose of bFGF unchanged, as the prolong of time, α-SMA mRNA expression increased significantly, the difference was statistically significant between 1 hour and 6 hours (P<0.05); After bFGF activation for 6 hours, α-SMA mRNA value reached the highest level, after added PD98059, α-SMA mRNA expression reduced, and further decreased with the antagonist action time increased, there was no significant difference between 1 hour and 6 hours (P>0.05). Conclusion bFGF can promote the proliferation of HLEC with time dependence under the stable low dosage. bFGF can promote the α-SMA secretion in HLEC and HLEC differentiation with time and dose dependence.

楊楠，女，1983年4月出生，碩士。聯(lián)系電話：13550909748；E-mail：54935193@qq.com

AboutYANGNan:Female,born in April,1983.Tel:13550909748;E-mail:54935193@qq.com

2013-12-26

646000 四川省瀘州市，瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科

楊楠,康剛勁,董敏.bFGF與ERK1/2阻斷劑對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞α平滑肌肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)的影響[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(4):326-329.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0088

修回日期：2014-01-12

本文編輯：董建軍

Accepteddate:Jan 12,2014

From theDepartmentofOphthalmology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,SichuanProvince,China

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):326-329]