骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中Fas和FasL表達(dá)的影響△

曲群 曹永亮 李娜娜 韓延燕 梁冰

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中Fas和FasL表達(dá)的影響△

曲群 曹永亮 李娜娜 韓延燕 梁冰

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植；Fas; FasL

目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)移植對大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemia reperfusion injury，RIRI)凋亡相關(guān)因子Fas和FasL表達(dá)的影響。方法體外貼壁篩選法培養(yǎng)大鼠BMSC。將39只健康成年SD大鼠隨機分成正常組3只、模型組18只、BMSC移植組18只。各組大鼠均選擇右眼作為實驗眼建立大鼠RIRI模型，正常組不做任何處理。另2組大鼠于RIRI后1 h分別給予玻璃體腔注射PBS緩沖液(模型組)、BMSC(BMSC移植組)，并于RIRI后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h各隨機處死3只SD大鼠，迅速摘取右眼。免疫組織化學(xué)法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織Fas和FasL的陽性細(xì)胞數(shù)情況。結(jié)果正常視網(wǎng)膜組織中Fas極少表達(dá)，F(xiàn)asL視網(wǎng)膜全層低表達(dá)。RIRI后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，模型組Fas陽性細(xì)胞數(shù)分別為(20.5±0.9)個·mm-2、(263.6±15.6)個·mm-2、(583.5±15.8)個·mm-2、(1184.6±45.5)個·mm-2、(684.5±3.5)個·mm-2、(80.6±4.5)個·mm-2，BMSC移植組分別為(19.8±0.8)個·mm-2、(238.5±14.7)個·mm-2、(473.6±13.6)個·mm-2、(964.5±23.7)個·mm-2、(632.6±5.8)個·mm-2、(72.5±6.3)個·mm-2;模型組FasL陽性細(xì)胞數(shù)分別為(42.2±0.9)個·mm-2、(57.3±0.9)個·mm-2、(365.8±7.5)個·mm-2、(1004.3±17.9)個·mm-2、(793.5±8.6)個·mm-2、(210.6±4.9)個·mm-2，BMSC移植組分別為(40.5±0.8)個·mm-2、(55.6±0.7)個·mm-2、(351.2±6.8)個·mm-2、(992.8±6.0)個·mm-2、(683.4±12.9)個·mm-2、(206.3±4.7)個·mm-2。與模型組比較，BMSC移植組各時間點Fas、FasL的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。Fas在6～48 h各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),FasL在12～48 h各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論RIRI后Fas/FasL表達(dá)水平升高，而玻璃體腔內(nèi)注射BMSC抑制Fas/FasL的表達(dá)，證明BMSC移植對RIRI有治療作用。

[眼科新進展，2014，34(4)：310-313]

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemic reperfusion injury，RIRI)是眼科臨床常見的病理過程，其發(fā)生機制十分復(fù)雜[1]，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)重影響患者的視力。RIRI的防治研究已成為近年眼科研究的熱點。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BMSC)是一類未分化的原始祖細(xì)胞，本實驗通過制備大鼠RIRI模型，探索玻璃體腔注射BMSC對大鼠RIRI的治療作用及對凋亡因子Fas、FasL表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組成年健康無眼疾SD大鼠39只(雌雄不限)，體質(zhì)量250～300 g，室溫環(huán)境喂養(yǎng)，隨機分為正常組3只、模型組18只、BMSC移植組18只，后兩組根據(jù)缺血再灌注時間分別分為2 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 6個亞組。各組大鼠均選擇右眼作為實驗眼。

1.2BMSC分離、培養(yǎng)、鑒定

1.2.1BMSC分離、培養(yǎng)采用體外貼壁篩選法培養(yǎng)大鼠BMSC。5周齡健康雄性SD大鼠10 g·L-1戊巴比妥鈉麻醉處死，無菌條件下分離雙側(cè)股骨并切開骨兩端關(guān)節(jié)面，PBS緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液以1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，重懸按(1.0～1.2)×109L-1的細(xì)胞濃度在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。48～60 h后首次換液，棄未貼壁細(xì)胞，此后隔天換液，13～15 d后鏡下觀察細(xì)胞融合至80%～90%時按12進行傳代培養(yǎng)，收集傳4～5代BMSC備移植用。

1.2.2BMSC的鑒定

1.2.2.1BMSC形態(tài)學(xué)變化倒置相差顯微鏡觀察BMSC生長情況。剛接種的細(xì)胞懸浮呈球形，24～36 h后細(xì)胞大部分貼壁生長，呈紡錘形，繼而細(xì)胞增多，體積增大，向四周呈放射狀擴展。傳代后細(xì)胞生長旺盛，呈長梭形分布。

1.2.2.2BMSC抗原鑒定應(yīng)用檢測BMSC陽性和陰性表達(dá)的抗原鑒定。取生長良好的傳4～5代細(xì)胞，采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(SABC)檢測細(xì)胞表面抗原CD44和CD45的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CD44表達(dá)呈陽性而CD45表達(dá)呈陰性，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSC。

1.3動物模型制備前房加壓法制備大鼠RIRI模型[2]，正常組不做任何處理。10 g·L-1戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，固定。復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳(右眼)，鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉。將連接250 mL生理鹽水的輸液器針頭從大鼠右眼的顳側(cè)角鞏膜緣刺入前房并固定，保持液平面與大鼠前房垂直距離約150 cm，此時可見球結(jié)膜蒼白、角膜霧狀水腫混濁、前房變深，間接眼底鏡見視網(wǎng)膜色淡，血流中斷，持續(xù)加壓90 min，緩慢降低前房壓力至拔出針頭，可觀察到球結(jié)膜充血、角膜恢復(fù)透明，視網(wǎng)膜血供恢復(fù)，RIRI模型成功建立。術(shù)后氯霉素滴眼液滴右眼(4次·d-1)預(yù)防感染。

1.4BMSC玻璃體腔注射RIRI模型建立后1 h，消毒手術(shù)區(qū)，抽取5 μL PBS懸液或5 μL含有BMSC的PBS懸液(45×103～50×103個活細(xì)胞)，顯微鏡下自右眼顳側(cè)角鞏膜緣分別注入模型組或BMSC移植組大鼠玻璃體腔內(nèi)[3-4]，術(shù)后氯霉素滴眼液滴右眼(4次·d-1)。

1.5標(biāo)本的采集、處理各組大鼠按時間點隨機麻醉處死，立即摘除右眼，置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定液中固定24 h，流水沖洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片。

1.6Fas/FasL免疫組織化學(xué)染色切片、展片、撈片、烤片，脫蠟入水，滴加體積分?jǐn)?shù)0.3% H2O2孵育，抗原修復(fù)，山羊血清封閉，后依次滴加一抗、生物素化二抗，SABC、DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。

2 結(jié)果

2.1視網(wǎng)膜Fas的表達(dá)正常組Fas極少表達(dá)；RIRI后2 h模型組和BMSC移植組呈淺黃至棕黃色顆粒狀染色的陽性表達(dá)仍極少，6 h后開始少量表達(dá)，主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層以及神經(jīng)纖維層，12 h明顯增多，同時出現(xiàn)在內(nèi)核層，24 h達(dá)到高峰(圖1-圖2)，48 h后開始減少，至72 h明顯下降，但仍有低表達(dá)；BMSC移植組各時間點的陽性細(xì)胞數(shù)均低于模型組，陰性對照未見陽性細(xì)胞。其中6 h、12 h、24 h、48 h組2組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05，見表1)。

2.2視網(wǎng)膜FasL的表達(dá)正常組FasL視網(wǎng)膜全層低表達(dá)；RIRI后2 h、6 h模型組和BMSC移植組呈棕黃至棕褐色顆粒狀染色的陽性表達(dá)增加不明顯，12 h開始升高，主要見于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層以及神經(jīng)纖維層，24 h達(dá)到高峰(圖3-圖4)，48 h開始減少，72 h仍有較高表達(dá)但低于48 h；BMSC移植組各時間點陽性細(xì)胞數(shù)均低于模型組，陰性對照未見陽性細(xì)胞。其中12 h、24h、48 h組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05,見表2)。

表1 模型組與BMSC移植組不同時間點Fas的陽性細(xì)胞數(shù)Table 1 Number of Fas positive cells in model group and BMSC transplantation group at different time points(±s,cell·mm-2)

表2 模型組與BMSC移植組不同時間點FasL的陽性細(xì)胞數(shù)Table 2 Number of FasL positive cells in model group and BMSC transplantation group at different time points(±s,cell·mm-2)

Figure 1 Expression of Fas in retina of model group at 24 hours after RIRI(×400) 模型組RIRI后24 h視網(wǎng)膜Fas的表達(dá)情況(×400)

Figure 2 Expression of Fas in retina of BMSC transplantation group at 24 hours after RIRI(×400) BMSC移植組RIRI后24 h視網(wǎng)膜Fas的表達(dá)情況(×400)

Figure 3 Expression of FasL in retina of model group at 24 hours after RIRI (×400) 模型組RIRI后24 h視網(wǎng)膜FasL的表達(dá)情況(×400 )

Figure 4 Expression of FasL in retina of BMSC transplantation group at 24 hours after RIRI(×400) BMSC移植組RIRI后24 h視網(wǎng)膜FasL的表達(dá)情況(×400 )

3 討論

RIRI在眼科疾病中普遍存在，常見于青光眼、視網(wǎng)膜血管阻塞性疾病以及影響視網(wǎng)膜血流的手術(shù)操作。但在臨床治療過程中，RIRI的發(fā)生機制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)氧自由基的連鎖反應(yīng)及鈣超載是引起組織損傷的主要環(huán)節(jié)[5]，而凋亡可能是RIRI中視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡的主要形式[6]。許多因素參與了對細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其中Fas/FasL的膜受體死亡通路是其調(diào)控的關(guān)鍵。Fas是一種啟動細(xì)胞外源性死亡受體途徑的細(xì)胞凋亡因子，是細(xì)胞表面的膜受體蛋白，屬于神經(jīng)生長因子受體及腫瘤壞死因子受體超家族的成員。FasL是其天然的配體，與Fas是三維對稱結(jié)構(gòu)，這種互補的結(jié)合形式既可以發(fā)生在相鄰的細(xì)胞間，又可以在相同的細(xì)胞上，或是自攜帶的細(xì)胞表面游離再與Fas結(jié)合[7],向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號，然后通過Caspase家族引起一系列級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致陽性表達(dá)Fas的靶細(xì)胞不可逆性凋亡。

BMSC是存在于骨髓組織中的非造血干細(xì)胞，具有多向分化的潛能[8]及良好的可塑性，視網(wǎng)膜移植后可存活[9]，又有定向遷移能力[10]，缺少免疫性且組織融合性好。此外由于取材充足、培養(yǎng)技術(shù)簡單、可冷凍保存，不違背倫理道德等特點使其成為細(xì)胞基因治療研究中的理想種子細(xì)胞，具有重要潛在的臨床應(yīng)用價值。同時Rosenbaum等[11]發(fā)現(xiàn)在大鼠腦RIRI中Fas/FasL的表達(dá)升高，同時神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與Fas/FasL的表達(dá)位置相符。實驗結(jié)果表明在正常視網(wǎng)膜組織中Fas極少表達(dá)但FasL低度表達(dá)，說明了Fas/FasL系統(tǒng)存在于正常視網(wǎng)膜組織中。RIRI后Fas和FasL的陽性細(xì)胞數(shù)較正常組明顯升高，主要見于神經(jīng)纖維層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；同時發(fā)現(xiàn)Fas/FasL表達(dá)的高峰時間相同,而且高表達(dá)的部位也是細(xì)胞凋亡的主要位置，其表達(dá)規(guī)律與Rosenbaum等[11]的研究相一致，提示Fas/FasL的過度表達(dá)可能導(dǎo)致了視網(wǎng)膜靶細(xì)胞的凋亡。72 h后FasL持續(xù)維持在高表達(dá)狀態(tài)說明其對靶細(xì)胞的損傷是持續(xù)存在的。此外向玻璃體腔內(nèi)注射BMSC可明顯降低Fas/FasL的陽性表達(dá)，F(xiàn)as陽性細(xì)胞數(shù)在12～24 h BMSC移植組較模型組明顯減少，而FasL在12～48 h明顯減少。由此可推測：抑制Fas/FasL過度表達(dá)、進而抑制細(xì)胞凋亡可能是BMSC治療RIRI的作用機理之一。

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date：Nov 26,2013

Natural Science Foundation of Shandang Province(No:Y2007C084)；Foundation of Education Department of Shandong Province(No:J07YE02)From theDepartmentofOphthalmology,WeifangMedicalCollege(QU Qun,HAN Yan-Yan),Weifang261042,ShandongProvince,China;DepartmentofOphthalmology,AffiliatedHospitalofWeifangMedicalCollege(CAO Yong-Liang,LIANG Bing),Weifang261031,ShandongProvince,China;ShangdongLunanEyeHospital(LI Na-Na),Linyi276000,ShandongProvince,China

Effects of bone marrow mesenchymal stem cells transplantation on expressions of Fas and FasL in retinal ischemia reperfusion injury

QU Qun,CAO Yong-Liang,LI Na-Na,HAN Yan-Yan,LIANG Bing

retinal ischemia reperfusion injury; bone marrow mesenchymal stem cells transplantation; Fas; FasL

Objective To probe into the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC)transplantation on expressions of Fas and FasL in rat retinal ischemia reperfusion injury(RIRI). Methods Adherent screening method was used to culture rat BMSCinvitro.Thirty-nine healthy adult SD rats were random divided into three groups: normal group (3 cases), model group (18 cases)and BMSC transplantation group (18 cases).The rats of model group and BMSC transplantation group were selected the right eye as the experimental eye and the model of RIRI was established, the normal group without any treatment. At 1 hour after RIRI, the rats of model group and BMSC transplantation group were separately intravitreal injected PBS buffer solution and BMSC, and then each group respectively were sacrificed 3 rats randomly at 2 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours after RIRI, and eyeballs were extracted rapidly. The expressions of Fas and FasL were detected by immunohistochemistry assay.Results In normal retinal tissue, Fas was rarely expressed and FasL was in low expression. At 2 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours, 72 hours after RIRI, the levels of Fas in model group were (20.5±0.9)cell·mm-2, (263.6±15.6)cell·mm-2, (583.5±15.8)cell·mm-2, (1184.6±45.5)cell·mm-2, (684.5±3.5)cell·mm-2, (80.6±4.5)cell·mm-2, respectively, and in BMSC transplantation group were (19.8±0.8)cell·mm-2, (238.5±14.7)cell·mm-2, (473.6±13.6)cell·mm-2, (964.5±23.7)cell·mm-2, (632.6±5.8)cell·mm-2, (72.5±6.3)cell·mm-2, respectively; The levels of FasL in model group were (42.2±0.9)cell·mm-2, (57.3±0.9)cell·mm-2, (365.8±7.5)cell·mm-2, (1004.3±17.9)cell·mm-2, (793.5±8.6)cell·mm-2, (210.6±4.9)cell·mm-2, respectively, and in BMSC transplantation group were (40.5±0.8)cell·mm-2, (55.6±0.7)cell·mm-2, (351.2±6.8)cell·mm-2, (992.8±6.04)cell·mm-2, (683.4±12.9)cell·mm-2, (206.3±4.7)cell·mm-2, respectively. Compared with the model group, the number of Fas/FasL positive expression at each time point in BMSC transplantation group decreased significantly. Fas had a statistically significant difference between 2 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours groups (P<0.05), FasL had a statistically significant difference between 12 hours, 24 hours, 48 hours groups (P<0.05).Conclusion The expressions of Fas and FasL increase after RIRI, but the intravitreal injection of BMSC can inhibit the expressions of Fas and FasL, which prove that BMSC transplantation has a therapeutic effect on RIRI.

曲群，女，1986年出生，碩士。主要研究方向：玻璃體視網(wǎng)膜疾病。E-mail：qququn@163.com

AboutQUQun：Female,born in 1986.Master degree.E-mail：qququn@163.com

2013-11-26

山東省自然科學(xué)基金資助(編號:Y2007C084)；山東省教育廳基金資助(編號：J07YE02)

261042 山東省濰坊市，濰坊醫(yī)學(xué)院眼科教研室(曲群，韓延燕)；261031 山東省濰坊市，濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科中心(曹永亮，梁冰)；276000 山東省臨沂市，山東省魯南眼科醫(yī)院(李娜娜)

曹永亮，E-mail:caoyongliang1965@163.com

曲群,曹永亮,李娜娜,韓延燕,梁冰.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中Fas和FasL表達(dá)的影響[J].眼科新進展,2014,34(4):310-313.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0084

修回日期：2014-01-04

本文編輯：董建軍

Accepteddate:Jan 4,2014

Responsibleauthor:CAO Yong-Liang,E-mail:caoyongliang1965@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(4):310-313]