紅曲液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)橙、黃色素及其色調研究

黃 艷，王 璐，毛 鵬，牛國強，張薄博，許贛榮，*

（1.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122;2.江漢大學生命科學學院，湖北武漢 430056）

目前公認的紅曲色素有6種，呈現(xiàn)橙、黃、紅三色。其中橙色的是紅曲玉紅素和紅斑紅曲素;黃色的是安卡紅曲黃素和紅曲素;紅色的是紅斑玉紅胺和紅斑紅曲胺。此外還有復合水溶性紅色素。

在食品著色劑方面，橙、黃色素是重要的食用色素品種。但目前國內的天然橙、黃色素的研究和開發(fā)還處于起步階段，目前市場上是以采用化學還原法生產(chǎn)的半天然的紅曲黃色素［1］為主?；谑称钒踩珕栴}，化學合成色素逐漸被天然色素取代，因而天然色素呈現(xiàn)供不應求的勢頭，其生產(chǎn)方法包括微生物發(fā)酵法和植物提取法［2］。植物來源的天然黃色素為提取法生產(chǎn)的梔子黃、姜黃、南瓜黃等［3］，這類色素的生產(chǎn)受季節(jié)影響大，成本高;微生物發(fā)酵法可大規(guī)模長年化生產(chǎn)，成本低。因此，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的天然紅曲橙、黃色素是繼紅曲紅色素之后很有市場潛力的色素［4］。

從技術上來講，微生物發(fā)酵法可利用突變的紅曲菌株，或通過微生物發(fā)酵條件的控制來達到主產(chǎn)某一類色素的目的。泰國 Yongsmith［5－7］等人通過誘變選育到了單產(chǎn)黃色素產(chǎn)生菌，但液態(tài)發(fā)酵黃色素色價不高，至今未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn);日本也研究開發(fā)紅曲黃色素并實現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)［8］;在國內，周波［9］等人通過誘變選育出了紅曲黃色素產(chǎn)生菌，但色價值僅達110U/mL。

紅曲菌生產(chǎn)色素，是一個復雜的代謝過程［10－11］，最先合成的色素是橙色素，再進一步被還原成黃色素，或者轉化成紅色素。本研究從眾多紅曲菌中廣泛篩選菌落顏色偏黃的菌株，通過微生物發(fā)酵條件的控制，使紅曲菌不產(chǎn)紅色素而只產(chǎn)橙、黃色素。對紅曲發(fā)酵液中橙、黃色素的有關特性進行了研究，主要研究內容包括橙、黃色素提取液全波長掃描最大吸收峰及其所對應的波長、色調、色價及其薄層層析分析。為紅曲黃、橙色素的生產(chǎn)開發(fā)及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅 曲 菌Monascussp.961，Monascussp.981，Monascussp.9085，Monascussp.FZ，Monascussp.W1，Monascussp.NEW，Monascussp.ZK－1，Monascussp.ZK－2，Monascussp.ZK－3，Monascussp.ZMI 均為本實驗室保藏菌種。

斜面PDA培養(yǎng)基（g/L）:馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂20，pH 自然。

種子培養(yǎng)基（g/L）:玉米淀粉40，玉米漿粉10，酵母膏 10，KH2PO42.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，初始pH為5。

搖瓶發(fā)酵基本培養(yǎng)基（g/L）:蔗糖60，玉米漿粉5.0，大豆粉 5.0，KH2PO42.0，K2HPO42.0，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.03，NaNO35.0，初始 pH 為 5。

HY－G－a回旋式恒溫調速搖床柜 上海躍進醫(yī)療器械廠;JLJ－001全波長自動掃描分光光度計 日立有限公司;PYX－XHS－405電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及發(fā)酵方法

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 500mL三角瓶裝液量100mL，接種孢子懸浮液 10mL，28℃，140r/min，培養(yǎng) 30h。

1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng) 500mL三角瓶裝液量50mL，接入種子液 5mL，32℃，170r/min，培養(yǎng) 6d。

1.2.2 菌種篩選 紅曲菌所產(chǎn)色素是紅色素、橙色素和黃色素所組成的復合色素，一般情況下，以紅色素為主。將實驗室保藏的眾多紅曲菌接種到PDA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，觀察比較菌落的顏色，篩選菌落顏色偏黃的菌株，對其分別進行搖瓶發(fā)酵復篩，培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法見1.1和1.2.1。

1.2.3 色價及色調測定 參考文獻［12－13］，將發(fā)酵液用研磨混勻后取1mL于50mL比色管中，用乙醇定容至50mL，顛倒混勻，置于55℃恒溫水浴中浸提40min。浸提結束后，取出冷卻至室溫，用乙醇稀釋適當倍數(shù)，并以乙醇為空白對照在200～600nm范圍內進行全波長掃描，測定OD值。

橙色價（U/mL）=OD值（465nm）×總稀釋倍數(shù)

黃色價（U/mL）=OD值（410nm）×總稀釋倍數(shù)

色調值=黃色價/橙色價

1.2.4 色素層析 參考文獻［14］，色素樣品:用甲醇從紅曲菌發(fā)酵液中粗提色素。

展開劑:甲苯/乙酸乙酯/甲酸:7/3/1

在層析缸內倒入展開劑，平衡20min。用毛細管吸取上述色素樣品1mL，點滴在吹干后的層析板出發(fā)線上，將層析板放入層析缸內，用壓板蓋實，開始進行層析。當溶劑前沿到達距層析板頂部3～5cm時，將層析板取出，觀察層析板上色素條帶，并計算Rf值。

Rf值=色素條帶距出發(fā)線的距離/溶劑前沿距出發(fā)線的距離

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)橙、黃色素紅曲菌株發(fā)酵性能比較

經(jīng)篩選獲得的10株紅曲菌發(fā)酵液掃描圖和色價測定結果如圖1和表1所示，實驗方法見1.2.2和1.2.3

圖1 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵色素提取液全波長掃描圖Fig.1 Absorption spectrum of Monascus pigments extracts by fermentation liquor

圖1是從表1中10株顏色偏黃紅曲菌中選取的5株有代表性的紅曲發(fā)酵色素提取液的全波長掃描圖。圖1a是產(chǎn)紅色調色素的紅曲發(fā)酵液全波長掃描圖，其特點是有二個吸收峰，分別為紅色素（505nm）和黃色素（410nm）吸收峰。一般沒有橙色素吸收峰（因橙色素一部分被轉化為紅色素，一部分轉化為黃色素）［10－11］。圖1中除 a之外的掃描圖譜結果表明，這些紅曲菌的發(fā)酵液中已經(jīng)沒有紅色素特征吸收峰（505nm），只有橙色素（465nm）和黃色素（410nm左右）特征吸收峰，說明初篩出的10株紅曲菌已不產(chǎn)紅色素，而只產(chǎn)黃色素和橙色素。

表1 紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)色素性能的比較Table 1 Comparision on the submerged fermentation of different Monascus spp.

表1為這10株紅曲菌發(fā)酵液色素性能的比較，色調值是黃色素色價與橙色素色價的比值，色調值越大，發(fā)酵液顏色越偏黃，反之則偏橙。如表1所示，Monascussp.NEW、Monascussp.961、Monascussp.ZK－1和Monascussp.9085的色調值較高，說明這四株菌主要產(chǎn)黃色素，而產(chǎn)橙色素較少。這四株菌中，Monascussp.961主產(chǎn)黃色素，僅在404nm處有唯一的吸收峰，其色價最高，高達200U/mL，高于已報道的其它研究結果［9，15－16］，是一株有潛力的紅曲黃色素生產(chǎn)菌。其余的六株菌主要產(chǎn)橙色素，其中Monascussp.W1產(chǎn)橙色素色價最高，可達436U/mL，也是一株有潛力的紅曲橙色素生產(chǎn)菌。

2.2 兩株高產(chǎn)色素紅曲菌發(fā)酵液色素的分離及解析

根據(jù)發(fā)酵液所呈現(xiàn)的色澤以及實驗2.1的分析結果，確定Monascussp.961為天然黃色素高產(chǎn)菌，Monascussp.W1為天然橙色素高產(chǎn)菌。為了解發(fā)酵液中色素的種類及相對純度，采用薄層層析分析對這兩株紅曲菌發(fā)酵液色素提取液進行分離及解析，結果見圖2。

Monascussp.961發(fā)酵液呈現(xiàn)誘人醒目的黃色;在普通光照下，尤其是熒光燈下，可看到的主要色素是黃色素，其次還有少量橙色素。此發(fā)酵液色素有6條色帶，其中最上部的Rf值為0.87和0.81的條帶，是黃色素和橙色素，但二者未分開，其余的均為黃色條帶（圖2左）。Monascussp.W1發(fā)酵液色澤呈現(xiàn)鮮艷奪目的橙色;在普通光照下（結合熒光燈下），可看到主要色素是橙色素，其次還有黃色素。其中Rf值為0.81的條帶為橙色素，其余5條為黃色色帶（圖2右）。結合發(fā)酵液顏色及板層析結果推斷，在一定發(fā)酵條件下，Monascussp.961可發(fā)酵生產(chǎn)黃色調為主的色素，而Monascussp.W1可發(fā)酵生產(chǎn)橙色調為主的色素。

圖2 Monascus sp.961和Monascus sp.W1色素板層析結果Fig.2 Separation of pigments by TLC of Monascus sp.961 and Monascus sp.W1

2.3 國內外紅曲黃色素及相關標準中有關指標的比較和討論

從技術經(jīng)濟角度來考察微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲橙、黃色素的可行性，有三個基本要求，首先要求所產(chǎn)生的色素是真正的天然色素，這才符合今后食品安全的大方向;其次是要求色素發(fā)酵液的色價高，這是工業(yè)化生產(chǎn)的基本要求;第三是所產(chǎn)的黃色素或橙色素應符合其特征性，即在檢測時色素的最大吸收峰應位于黃色素或橙色素的特征波長之下。表2列出了國內外研究論文及市場上曾銷售過的紅曲黃色素的有關特征參數(shù)。

序號為4的水溶性紅曲黃其吸收峰在476nm處。這種色素是通過化學轉化法生產(chǎn)的半天然紅曲黃色素，其最大吸收峰在470～490nm之間，而從色調上分析，應是以橙色為主。日本標準中，紅曲黃是以50%乙醇溶解后，在波長458～468nm范圍內以最大吸收峰值計算色價;韓國的紅曲黃標準中則提出最大吸收峰是在460nm處附近;Yongsmith等人［18］通過誘變選育的紅曲霉所產(chǎn)黃色素吸收峰在370nm處，但其也提到有的突變株所產(chǎn)生的紅曲黃色素有三個波峰，分別為500、420、370nm，這種色素可能是多種紅曲色素的混合物。因而可以得知，紅曲菌在一定發(fā)酵條件下可以產(chǎn)生不同色調的黃色素。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)純黃色素的微生物資源較少，序號為8、9、10的紅曲菌發(fā)酵液的最大吸收峰為370、410nm和404nm，這些菌株可認為是以生產(chǎn)黃色素為主的紅曲菌;從色價上看，序號為10的紅曲菌株略勝一籌。而序號為11的紅曲菌發(fā)酵液橙色素（465nm）的色價達到436U/mL，已初步具有工業(yè)化生產(chǎn)的價值。

3 結論

首先，本文研究了紅曲發(fā)酵液中以橙、黃色調為主的色素的有關特性，根據(jù)色素提取液的全波長掃描圖譜中吸收峰所對應的波長，可確定其主要色調為橙色和黃色。其次，對上述兩株菌所產(chǎn)色素提取液進行了硅膠薄層層析研究，根據(jù)呈現(xiàn)的色素條帶，進一步明確了其所產(chǎn)色素的類型為橙色或黃色;最后，對國內外黃色素產(chǎn)品標準中的特征參數(shù)以及部分黃色素產(chǎn)品的相關參數(shù)，以及國內外天然色素和市場的半天然色素的吸收峰進行了比較分析，確定了本實驗篩選菌株所產(chǎn)色素的最大吸收峰符合天然黃、橙色素的吸收峰范圍。根據(jù)實驗結果，挑選出了高產(chǎn)黃色素（Monascussp.961）和高產(chǎn)橙色素（Monascussp.W1）的紅曲菌株，色價分別為200U/mL和436U/mL，且其液態(tài)發(fā)酵液色素的色價相對較高，可望運用于規(guī)模化生產(chǎn)。

表2 國內外紅曲橙、黃色素的比較Table 2 The comparision of Monascus orange/yellow pigments in domestic and overseas

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