硫化氫拮抗同型半胱氨酸刺激血小板聚集作用

崔玉英，王穎，王桂芳，張玉華，問慧娟

（1.河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2.安國市醫(yī)院 腦外科，河北 安國 071200；3.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室，河北 保定 071000）

硫化氫（H2S）和同型半胱氨酸（homocysteinemia，HCY）均為體內(nèi)蛋氨酸代謝產(chǎn)物，蛋氨酸轉(zhuǎn)移甲基后由S－腺苷HCY 脫腺苷生成HCY，HCY 通過轉(zhuǎn)硫途徑代謝生成H2S［1－3］，即HCY 在維生素B6依賴的胱硫醚－β－合成酶和胱硫醚－γ－裂解酶作用下被代謝為半胱氨酸、NH4＋及α－酮丁酸.半胱氨酸進(jìn)一步分解形成H2S，α－酮丁酸以及?；撬幔?－4］.任何原因?qū)е碌拇x酶缺陷（如維生素B6、B12和葉酸缺乏等）均可造成HCY 在體內(nèi)蓄積，造成高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocysteinemia，HHCY），導(dǎo)致內(nèi)皮功能損害及血小板過度活化，引發(fā)動靜脈血栓形成和血管功能紊亂，是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［4－5］.

H2S作為HCY 的代謝產(chǎn)物，是繼NO 后又一新的氣體信號分子，具有舒張血管平滑肌、抑制心肌收縮力和血管平滑肌增殖、抑制血小板聚集等多種心血管生物學(xué)效應(yīng)［6－8］，是調(diào)節(jié)循環(huán)穩(wěn)態(tài)的重要的組織局部因子，在心肌缺血、血管鈣化等多種心血管疾病發(fā)病中都具有重要的病理生理意義［8－10］.近年來研究發(fā)現(xiàn)H2S能減低HHCY 血癥大鼠血漿HCY 的水平［6］，提示蛋氨酸代謝產(chǎn)物HCY 和H2S在生物學(xué)效應(yīng)方面可能存在相互關(guān)系，但H2S對HHCY 血小板聚集功能的影響及機(jī)制尚不清楚.

本工作在高濃度HCY 與血小板離體孵育的模型上，采用不同濃度的H2S生理鹽水溶液干預(yù)，觀察血小板聚集功能和NO 釋放的改變，以探討H2S在HHCY 誘導(dǎo)血栓形成等心血管疾病發(fā)病中的可能作用.

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD 大鼠，體重230～250g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；按照河北大學(xué)動物管理?xiàng)l例和中華人民共和國衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理實(shí)施細(xì)則執(zhí)行.左旋精氨酸（L－Arg）、LD－同型半胱氨酸（LD－HCY）、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）、對氨基苯磺胺和N－（1－萘基）－乙二胺均購自Sigma公司.H2S飽和氣體生理鹽水溶液由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部心血管研究室提供.

1.2 血小板制備和實(shí)驗(yàn)分組［1，10－11］

大鼠禁食12h后采用戊巴比妥鈉（40mg／kg腹腔注射）麻醉，腹主動脈取血，按9:1的體積比用3.8g／L的枸櫞酸鈉抗凝并混勻，參考文獻(xiàn)［1，10－11］的方法制備富血小板血漿（PRP）和貧血小板血漿（PPP），調(diào)整血小板數(shù)為200×109／L用于血小板聚集實(shí)驗(yàn).

另取部分PRP按體積比1:10懸浮于不含Ca2＋但含EGTA 0.1mmol／L的Hepes緩沖液中（mmol／L：NaCl 137，MgCl21.0，KCl 2.7，NaH2PO43.0 和Hepes 3.5，pH 7.4），在4 ℃條件下1 500×g 離心10min后，棄上清液并重復(fù)洗脫1次.血小板重懸于Hepes緩沖液中（含葡萄糖10mmol／L），調(diào)整血小板數(shù)為1×108／mL.每管血小板混懸液1mL，分別加入下述藥物：1）對照組，加入等體積生理鹽水.2）HCY 組，加入HCY 100μmol／L.3）H2S組，加入H2S生理鹽水溶液50μmol／L.4）HCY＋H2S低、中、高和極高劑量組，均加入HCY 100μmol／L基礎(chǔ)上，同時(shí)分別加入H2S生理鹽水溶液10，50，100，1000μmol／L.各組在37 ℃恒溫水?。∣2與CO2體積比95:5）中震蕩孵育2h，結(jié)束孵育后4 ℃離心（1 500×g 離心5min），取孵育液待測亞硝酸鹽含量.

1.3 血小板聚集功能測定［4，7］

采用上海通用醫(yī)用儀器公司TYXN－91多功能智能血液聚集儀.參照文獻(xiàn)［4，7］，分別取300μL PPP和PRP（含血小板200×109／L）放于血小板聚集測定管中，按上述各實(shí)驗(yàn)分組加藥，于37 ℃恒溫水浴（O2與CO2體積比95:5）中震蕩孵育30min后，置于預(yù)熱孔并加入ADP 10μmol／L（致聚劑），以PPP組作為空白對照管，采用比濁法在血小板聚集儀上測定10min，分別測定2，4min時(shí)血小板聚集率和最大血小板聚集率（platelet aggregation，PAP）.

1.4 血小板NO 生成功能測定［10－11］

以血小板孵育液中亞硝酸鹽（NO2－）含量反映血小板NO 的生成.參照文獻(xiàn)［10－11］的方法，取血小板孵育液0.1mL，加入Greiss試劑0.1mL（20g／L對氨基苯磺胺和2g／L N－（1－萘基）－乙二胺按體積比1:1，臨用前混勻），10min 后，采用酶標(biāo)儀在550nm 波長下測定其吸光度值.以NaNO2作為空白對照管作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組樣品中每108血小板產(chǎn)生的亞硝酸鹽含量.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H2S拮抗HCY促血小板聚集作用

實(shí)驗(yàn)各組在37 ℃恒溫水浴箱中預(yù)孵育10min后，加入ADP 10μmol／L 后檢測10min，分別測定2，4min和最大的血小板聚集率.對照組血小板最大聚集率為（70.01±5.35）%.與對照組比，HCY 組可使ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率增加16%；H2S 組則使其減少21%（均P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)道相符［2，4］.但H2S（10，50，100，1 000μmol／L）和HCY 共孵育，呈濃度依賴的抑制ADP 誘導(dǎo)的血小板聚集，分別較單純HCY 組減少7%，15%，43%和38% （均P＜0.01），以H2S 100μmol／L 的 作 用 達(dá) 峰 值，H2S 100 和1 000μmol／L 2組的作用無顯著差異（P＞0.05）（表1）.

表1 H2S對HCY 刺激ADP誘導(dǎo)大鼠血小板聚集作用的影響Tab.1 Effects of H2S on HCY activated rats platelet aggregation which induced by ADP（10μmol／L）

2.2 H2S拮抗HCY抑制血小板NO 生成作用

血小板離體孵育2h 后，對照組每108血小板孵育液中NO2－含量為（3.63±0.05）nmol；HCY 組和H2S組較對照組分別減少50%和42%（均P＜0.01）；而H2S（10～1 000μmol／L）與HCY 100μmol／L共孵育，血小板孵育液中NO2－含量較HCY 組分別增加1.58（P＜0.05），2.05，1.77（P＜0.01）和1.52倍（P＜0.05）.Person相關(guān)分析，H2S拮抗HCY 促血小板聚集作用與血小板孵育液NO2－含量的改變呈顯著負(fù)相關(guān)，r2＝－0.438 7，P＜0.01.95%可信區(qū)間（confidence interval，95%CI）為－0.757 4～－0.278 2（圖1）.

圖1 H2S對HCY減少大鼠血小板NO 生成的影響Fig.1 Effects of H2S on the homocysteine decreased NO production in rat platelets

3 討論

血小板黏附聚集是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展和血栓形成的重要環(huán)節(jié)［1，11］，NO 是調(diào)節(jié)血小板活化的重要?dú)怏w信號分子，是由血液中L－精氨酸經(jīng)過細(xì)胞膜上陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)并在NO 合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化下產(chǎn)生，具有清除氧自由基、舒張血管平滑肌、抑制血小板黏附聚集及阻止動靜脈血栓形成的作用，對維持心血管功能穩(wěn)態(tài)和血小板自身穩(wěn)態(tài)具有重要作用［10－12］.HCY 在體內(nèi)極易氧化，產(chǎn)生大量氧自由基，對細(xì)胞廣泛損傷，干擾血小板NO 生成，促進(jìn)血小板活化和凝血，刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖、損害內(nèi)皮功能等［1－3］，是冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3－5］.

HCY 的代謝產(chǎn)物H2S，是調(diào)節(jié)血小板活化的又一種新的氣體信號分子，通過開放KATP通道抑制血小板黏附聚集［6－7］.近年來研究發(fā)現(xiàn)，H2S對心血管系統(tǒng)具有廣泛的保護(hù)作用，H2S能清除氧自由基，外源性補(bǔ)充H2S可減輕心臟缺血再灌注損傷，抑制血管鈣化，減輕頸動脈球囊拉傷大鼠內(nèi)膜的損害［12－14］.由于H2S和HCY 均為蛋氨酸代謝產(chǎn)物，共處于體內(nèi)同一代謝通路中胱硫醚－γ－裂解酶的上、下游，其生物學(xué)效應(yīng)的相互作用應(yīng)高度重視，但H2S對HHCY 時(shí)血小板聚集功能、NO 的影響及H2S和HCY 間的關(guān)系尚不清楚.

本實(shí)驗(yàn)顯示HCY 促進(jìn)血小板聚集，H2S 顯著抑制血小板聚集，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［3－5］.而不同濃度的H2S與HCY 共孵育，可拮抗HCY 刺激血小板聚集的效應(yīng)，其機(jī)制是否與NO 有關(guān)尚不清楚.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示HCY 和H2S單獨(dú)應(yīng)用均抑制血小板NO 釋放，與前期報(bào)道相符［1，9］；而H2S與HCY 共孵育，血小板NO生成較單獨(dú)H2S組、HCY 組增多，NO 生成與血小板最大聚集率的改變呈顯著負(fù)相關(guān).提示H2S 降低HHCY 血小板聚集率與改善NO 生成有關(guān)；在HHCY 時(shí)血小板聚集功能增強(qiáng)，而H2S本身具有抑制血小板聚集作用，又通過增加NO 生成，加強(qiáng)抑制血小板聚集作用，對維持血小板功能穩(wěn)態(tài)、防止血栓形成和動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展具有重要意義.

H2S改善HHCY 血小板功能的機(jī)制，除了與改善NO 生成有關(guān)外，也可能與H2S能清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［7－8］、保護(hù)線粒體功能、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)等保護(hù)機(jī)制有關(guān)［8－14］.實(shí)驗(yàn)中H2S極高劑量組對血小板最大聚集率和NO 作用弱于高劑量組，是H2S自身抑制作用占優(yōu)勢還是劑量過大對血小板的損傷有待進(jìn)一步探查.

機(jī)體通過釋放多種生物活性物質(zhì)以維持自身穩(wěn)態(tài)，各活性物質(zhì)間處于動態(tài)平衡的關(guān)系［2，5］.如蛋氨酸代謝的中間產(chǎn)物HCY 減少血小板NO 生成，促進(jìn)血小板聚集［1］；而終末產(chǎn)物H2S可抑制血小板聚集功能和NO 生成［10］；NO 又能抑制血小板聚集，促進(jìn)培養(yǎng)的血管平滑肌H2S 釋放［12］；而本工作顯示H2S 可改善HHCY 時(shí)血小板聚集功能和NO 生成，通過增加NO 生成，協(xié)同抑制血小板聚集以保持血小板功能穩(wěn)態(tài).提示蛋氨酸代謝產(chǎn)物HCY，H2S之間和氣體信號分子H2S，NO 間均各自具有相對獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)，但彼此間又相互作用形成復(fù)雜的“網(wǎng)絡(luò)”關(guān)系和動態(tài)平衡.這種動態(tài)平衡失調(diào)，參與高血壓、HHCY 和動脈粥樣硬化的病理生理過程［5，10］，因此，調(diào)整蛋氨酸－HCY－H2S代謝通路、增加內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)是防治HHCY 和動脈粥樣硬化的新思路，H2S作為HCY 生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)體內(nèi)源性拮抗劑在HHCY 和血栓性疾病防治中具有廣闊的應(yīng)用前景.

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