白洋淀烏鱧線粒體D－Loop區(qū)序列遺傳多樣性分析

董新培，穆淑梅，周楠，康現(xiàn)江，白俊杰

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380）

白洋淀地處京、津、保三市之間，是華北平原上的最大湖泊，素有“華北明珠”之譽，魚類資源豐富，經(jīng)濟魚類以鯉科為主，其次是鱧科、鲇科、鰍科和鲿科等［1］.近十幾年來，由于水資源匱乏和人類大規(guī)模生產(chǎn)活動的影響，嚴(yán)重破壞了白洋淀的生態(tài)平衡，從而導(dǎo)致白洋淀魚類在數(shù)量和種類上都發(fā)生了很大變化［2］.烏鱧（Channa argu）俗稱黑魚，屬鱸形目（Perciformes）、鱧科（Channidae）、鱧屬，是生活在河川、湖泊中的一種兇猛的肉食性魚類，分布較廣，遺傳資源豐富，最初在漁業(yè)生產(chǎn)中被視為養(yǎng)殖的害魚而被捕殺和清除［3－4］，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、少刺、味道鮮美、營養(yǎng)豐富及適應(yīng)性強等特點，目前已成為我國重要淡水經(jīng)濟魚類［5］.烏鱧種群作為白洋淀淀內(nèi)重要的經(jīng)濟魚類，對維持淀內(nèi)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)和生物遺傳多樣性具有重要意義.

線粒體DNA 為母系遺傳，基因組結(jié)構(gòu)簡單，進化的速度是核基因組的5～10倍，且不發(fā)生重組現(xiàn)象，線粒體DNA 遺傳標(biāo)記在魚類進化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究方面獲得了很多重要成果［6－8］.D－Loop區(qū)是線粒體上一段非編碼序列，位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間，是脊椎動物線粒體序列長度變異最大的區(qū)域，具有較高的突變率，在物種的進化過程中是線粒體基因組進化最快的部分，一般用于種內(nèi)和種群間的遺傳進化分析［7－9］.隨著PCR 技術(shù)的快速發(fā)展，PCR 測序技術(shù)更多地應(yīng)用于遺傳多樣性的研究，因其具有反應(yīng)快，穩(wěn)定性高等特點，較RFLP具有優(yōu)越性，深受廣大研究者的青睞［10－11］.2010年溫曉曦等［12］分離和篩選了烏鱧微衛(wèi)星序列，同年劉改艷等［13］利用SSR－BSA 技術(shù)對烏鱧性別差異標(biāo)記進行了初步篩選，劉蘇等［14］利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對斑鱧、烏鱧及其雜交種進行了遺傳差異的分析.而有關(guān)烏鱧線粒體D－Loop區(qū)的研究并未報道.本研究利用線粒體D－Loop區(qū)分析河北省白洋淀養(yǎng)殖與野生烏鱧群體中的線粒體D－Loop區(qū)的特征及其差異，分析該區(qū)養(yǎng)殖與野生烏鱧群體的遺傳多樣性，揭示烏鱧種群的遺傳特征，為白洋淀烏鱧天然和養(yǎng)殖資源調(diào)查和遺傳多樣性分析提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用野生烏鱧樣本30尾采自河北省白洋淀淀區(qū)內(nèi)；養(yǎng)殖樣本32尾購于河北省安新縣城水產(chǎn)市場，養(yǎng)殖群體親本為外地引進的養(yǎng)殖魚苗.活魚帶回實驗室，取背部肌肉組織，置于離心管內(nèi)，凍存于－80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 烏鱧總DNA的提取

每尾烏鱧取肌肉樣品20～30mg剪碎.采用蛋白酶K 進行消化，按常規(guī)酚－氯仿抽提法提取總DNA，得到的DNA 用雙蒸水充分溶解，并通過吸光值檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測來評價DNA 樣品的品質(zhì)，存于－20 ℃保存?zhèn)溆?

1.3 烏鱧線粒體控制區(qū)PCR 擴增及序列測定

擴增烏鱧線粒體D－Loop區(qū)的引物參照黃志堅等［15］發(fā)表的淡水魚通用引物，送上海生工生物工程有限公司進行合成，引物序列為

MitD1－F：5′－CACCCYTRRCTCCCAAAGCYA－3′；

MitD1－R：5′－GGTGCGGRKACTTGCATGTRTAA－3′.

PCR 反應(yīng)體系為50μL，其中含有10×Buffer 5μL、dNTP 1μL、2種引物各2μL、Taq DNA 聚合酶1μL、模板DNA 2μL、加ddH2O 至50μL.PCR 擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性2min，33個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30s，54℃退火50s，72℃延伸3min，最后72℃延伸10min，4℃保存.用10g／L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，送往上海生工生物工程有限公司進行雙向測序，使用PCR 擴增引物作為測序引物.

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Clustal X 1.81比對測序結(jié)果，輔以人工校對.利用MEGA4.1軟件統(tǒng)計序列的堿基含量及遺傳距離；通過DnaSP（version4.1）軟件統(tǒng)計單倍型（h）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（k），并計算群體間分化指數(shù)（Fst）和基因流（Nm）.利用鄰接法（Neighbor－Joining，NJ）基于Kimura雙參數(shù)（Kimura 2－parameter，K2P）模型構(gòu)建烏鱧群體系統(tǒng)發(fā)生樹，進化樹各分支的自舉置信度水平由自舉法（Bootstrap value）估計，自引導(dǎo)次數(shù)為1 000.

2 結(jié)果

2.1 烏鱧種群線粒體DNA D－Loop區(qū)序列特征

在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索出烏鱧線粒體DNA 全序列（GenBank登錄號GU937112），與擴增獲得的序列比對，找到烏鱧線粒體D－Loop區(qū)的起止位點，確定烏鱧線粒體D－Loop區(qū)序列全長為906～908bp，長度變異較小.T，C，A，G 堿 基 平 均 含 量 分 別 為28.14%，22.36%，34.38%，15.12%，其 中A＋T 的 含 量（62.52%）高于G＋C含量（37.48%），具有明顯的堿基組成偏向性.經(jīng)分析，養(yǎng)殖和野生烏鱧群體的線粒體D－Loop區(qū)的堿基組成呈該分布特點（表1）.

表1 烏鱧線粒體D－Loop區(qū)堿基組成Tab.1 Nucleotide compositions of mtDNA D－Loop in Channa argu

2.2 烏鱧種群遺傳多樣性分析

在62個烏鱧樣本線粒體D－Loop 區(qū)序列中，共檢測到112 個變異位點，占全部序列的12.3%；其中106個簡約信息位點，占全部序列的11.67%.其中轉(zhuǎn)換位點63 個，占總變異位點的56.25%，顛換位點35個，占總變異位點的31.25%，堿基轉(zhuǎn)換／顛換比值（R）為1.71.表2所示為養(yǎng)殖和野生烏鱧群體基于DLoop序列分析得到的遺傳多樣性參數(shù)，由表2可以看出，野生烏鱧群體的遺傳多樣性參數(shù)均低于養(yǎng)殖群體的.利用Kimura雙參數(shù)法計算2大群體內(nèi)部以及群體間的遺傳距離，結(jié)果表明：養(yǎng)殖群體的個體間遺傳距離為0～0.02，平均遺傳距離為0.01；野生群體的個體間遺傳距離為0～0.01，平均遺傳距離為0.005；而2個群體間的個體間遺傳距離為0～0.12，平均遺傳距離為0.06，相對于單個群體，群體間的遺傳距離較大.

表2 烏鱧種群線粒體D－Loop區(qū)序列的遺傳多樣性參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of mtDNA D－Loop sequence of Channa argu population

基于線粒體D－Loop區(qū)序列計算養(yǎng)殖和野生烏鱧群體間分化指數(shù)Fst為0.943 44，表明有94%的遺傳變異存在群體間，揭示了2群體間有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；基因流Nm為0.014 99，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，說明2群體間具有較大的遺傳分化.

2.3 烏鱧群體親緣關(guān)系樹

以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）顯示，野生和養(yǎng)殖烏鱧群體的個體各自聚集為獨立的分支，遺傳距離近的個體聚成一簇，且無交叉分支，即2群體間表現(xiàn)為明顯的分化.

3 討論

3.1 烏鱧線粒體D－Loop區(qū)序列堿基組成及序列變異

所測定的62尾烏鱧線粒體D－Loop區(qū)序列中，T（28.14%），C（22.36%），A（34.38%），G（15.12%）含量呈不均一性分布，且A＋T 的含量（62.52%）顯著高于G＋C 的含量（37.48%），這與其他魚類D－Loop區(qū)核苷酸組成特點相似［16］.線粒體D－Loop 區(qū)發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換的頻率（56.25%）顯著高于顛換的頻率（31.25%），這 與 同 目 的 大 黃 魚（Pseudosciaena crocea）［17］和鱸魚（Trachidermus fasciatus）［18］線粒體D－Loop區(qū)發(fā)生轉(zhuǎn)換頻率高于顛換的規(guī)律相符，具有較高的堿基替換率.

圖1 基于線粒體DNA D－Loop區(qū)序列構(gòu)建的烏鱧群體間的NJ樹Fig.1 NJ tree based on the mtDNA D－Loop sequence of Channa argu populations

3.2 烏鱧線粒體D－Loop區(qū)遺傳多樣性的分析

核苷酸多樣性（Pi）和平均遺傳距離是衡量一個群體的2 個重要指標(biāo)［19］.從烏鱧種群內(nèi)的Pi值來看，野生群體的核苷酸多樣性Pi（0.001 43）比養(yǎng)殖群體的Pi（0.009 64）低，與銀鯧（Pampus argenteus）［20］（野 生 群 體0.007 和 養(yǎng) 殖 群 體0.004）和斜帶髭鯛（Hapalogenys nitens）［21］（野生群體0.022 02和養(yǎng)殖群體0.022 77）相較，養(yǎng)殖和野生烏鱧群體的遺傳多樣性均為較低水平，而2個群體間的核苷酸多樣性卻明顯高于前兩者，主要表現(xiàn)為野生和養(yǎng)殖群體間核苷酸差異較大，說明養(yǎng)殖和野生群體間存在較大的遺傳差異.遺傳距離多用來分析不同群體間的遺傳分化程度和群體內(nèi)的遺傳多樣性［22］.養(yǎng)殖群體個體間的平均遺傳距離為0.01，野生群體內(nèi)個體間的平均遺傳距離為0.005，烏鱧種群內(nèi)個體間的平均遺傳距離為0.06，波動范圍較群體內(nèi)大，表現(xiàn)為群體間多態(tài)性較高.由此看出，烏鱧群體內(nèi)的差異很小，而種群間的序列差異很大.烏鱧2 個群體的Fst為0.943 44，Nm為0.014 99，表明養(yǎng)殖群體和野生群體間具有一定的遺傳分化，且基因交流比較匱乏.

綜上結(jié)果顯示，野生和養(yǎng)殖烏鱧群體的遺傳多樣性均為較低水平，且野生烏鱧群體的遺傳多樣性較養(yǎng)殖群體低，這個結(jié)果與以往野生群體遺傳多樣性較高不同.這可能是因為養(yǎng)殖群體在繁育過程中引入不同地點的烏鱧親本，一定程度上豐富了養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性；野生群體受自然因素和人為因素的影響導(dǎo)致遺傳多樣性降低.自然因素：白洋淀呈淺碟形的湖底，雖水域面積很大，容水量卻很小，魚群在小范圍內(nèi)生存活動，生存環(huán)境相對穩(wěn)定，與外界遺傳交流相對較少，因而導(dǎo)致野生群體在進化過程中表現(xiàn)出趨同性［23］.人為因素：上游修建了大量的水利工程設(shè)施，致使白洋淀的蓄水量逐年下降，造成了淀內(nèi)魚的種量減少，過度的捕撈也使得淀區(qū)自然魚類生態(tài)環(huán)境遭到破壞，致使一些經(jīng)濟魚類資源的衰退［2，24］.近幾年來開展了引水入淀工程，從研究結(jié)果分析烏鱧野生群體遺傳多樣性較低，種群相對比較穩(wěn)定，推測無淀外的烏鱧進入白洋淀或外來的數(shù)量不足以改變白洋淀群體的遺傳多樣性.

3.3 烏鱧群體系統(tǒng)發(fā)育分析

在此研究中所測烏鱧群體的62個樣本分屬于9種單倍型，養(yǎng)殖與野生群體內(nèi)的單倍型數(shù)分別為4與5，每個群體內(nèi)的單倍型都是其獨有的單倍型，養(yǎng)殖群體與野生群體間無共享單倍型.NJ系統(tǒng)樹也顯示2個群體各自聚集為獨立的分支.由于線粒體DNA 為母系遺傳，一般不發(fā)生重組，表明2個群體間具有一定的遺傳分化，為2個母系起源.

綜上所述白洋淀烏鱧種群在進化過程中單倍型多樣性和遺傳多樣性均比較低，這表明白洋淀烏鱧群體適應(yīng)環(huán)境的能力已經(jīng)減弱，因此有必要開展白洋淀烏鱧群體保護工作，根據(jù)白洋淀當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境特點，制定科學(xué)有效的保護措施，加強對野生和養(yǎng)殖烏鱧群體的保護.本研究僅僅是分析了白洋淀區(qū)域烏鱧資源遺傳多樣性，不能全面地反映不同地理群體烏鱧的遺傳多樣性水平與群體分化狀態(tài).今后將繼續(xù)應(yīng)用線粒體D－loop基因分析不同地區(qū)烏鱧群體的遺傳背景，以期全面揭示烏鱧資源的遺傳多樣性水平.

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