去鐵胺（DFO）誘導(dǎo)骨髓增生異常綜合征（MDS）細(xì)胞株SKM-1的P15INK 4B基因去甲基化

丁倩倩 陳勤奮 王小欽

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院血液科 上海 200040）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndr o me，MDS）是起源于造血干細(xì)胞的克隆性疾病，表現(xiàn)為粒系、紅系和巨核細(xì)胞系一系或多系發(fā)育異常和無效造血導(dǎo)致外周血一系或多系血細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，其轉(zhuǎn)歸是骨髓衰竭或演變?yōu)榧毙运栊园籽。╝cute myeloid leukemia，A ML）。近年來，MDS的表觀遺傳改變和鐵過載危害成為研究熱點(diǎn)。DNA異常甲基化是目前研究最多的MDS表觀遺傳改變，其中P15INK4B基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島的高度甲基化在血液系統(tǒng)腫瘤出現(xiàn)頻繁［1]，與 MDS的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)化為AML密切相關(guān)［2]，啟動(dòng)子區(qū)的高度甲基化可導(dǎo)致該抑癌基因失活［3－4]。同時(shí)，MDS患者由于骨髓無效造血反饋性刺激腸道鐵吸收增多以及反復(fù)紅細(xì)胞輸注等原因，導(dǎo)致鐵過載（iron overload），造成重要臟器損害，加速白血病的轉(zhuǎn)化，抑制造血功能，因此鐵過載是MDS總生存（overall survival，OS）和無白血病生存的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素［5－6]。除了去甲基化治療外，去鐵治療已被列入多個(gè)治療指南［5]。最新研究表明，在去甲基化治療前使血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）降至1 000μg／L以下，可獲得更高的總體反應(yīng)率（overall response，OR）和OS［7]。本研究首次采用鐵螯合劑去鐵胺（def er oxa mine，DFO）誘導(dǎo)鐵過載的 MDS細(xì)胞株SK M-1 P15INK4B基因去甲基化，以探討去鐵對(duì)MDS的治療作用，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

材料和方法

研究對(duì)象 MDS細(xì)胞株SK M-1來源于1名MDS-RAEBT轉(zhuǎn)化為A ML-M5的76歲男性患者的外周血，由本科室保存。SK M-1是研究MDS發(fā)生、發(fā)展、DNA重排改變以及基因不穩(wěn)定性的理想細(xì)胞株，呈淋巴細(xì)胞形態(tài)，強(qiáng)烈表達(dá)髓過氧化物酶［8－9]。

細(xì)胞培養(yǎng)及分組 SK M-1細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Hy Cl one公司）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（美國Ther mo公司）中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以1×106／ml密度接種于12孔板，1 ml／孔，分為3組（每組3復(fù)孔），分別為對(duì)照組、枸櫞酸鐵銨（ferric ammoiu m citrate，F(xiàn)AC）組和FAC＋DFO組。其中對(duì)照組不加FAC和DFO培養(yǎng)48 h；FAC組加入400μmol／L FAC（美國Sigma公司）培養(yǎng)48 h，使SK M-1細(xì)胞鐵過載；FAC＋DFO組加入400μmol／L FAC培養(yǎng)24 h后，換用含100μmol／L DFO（瑞士Novartis公司）的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以對(duì)鐵過載的SK M-1細(xì)胞進(jìn)行去鐵處理。3組分別收集細(xì)胞備用。

細(xì)胞內(nèi)可變鐵池（labile iron pool，LIP）的檢測(cè) 采用Calcein-A M單染法檢測(cè)LIP。收集3組細(xì)胞，無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106／ml，加入 Calcein-AM （美國 Sigma公司），終濃度為0.125μmol／L，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5 min，RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌2次，流式細(xì)胞儀（美國BD公司）檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。以對(duì)照組為基線，用MFI下降的百分比即相對(duì)熒光淬滅率反映LIP的相對(duì)水平，LIP （%）＝ （MFI對(duì)照組－MFI實(shí)驗(yàn)組／MFI對(duì)照組）×100%。

細(xì)胞內(nèi)活性氧類（reactive oxygen species，ROS）的檢測(cè) 收集3組細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106／ml，按ROS檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司）說明進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè) MFI。熒光探針DCFHDA本身沒有熒光，可自由穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，酯酶水解生成DCFH。DCFH不能通透細(xì)胞膜，探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的ROS可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。DCF的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。

P15INK4B基因甲基化的檢測(cè) 采用甲基化特異性PCR（MSP）法檢測(cè)P15INK4B基因的甲基化水平。收集3組細(xì)胞，按DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）說明提取DNA，按甲基化修飾試劑盒（美國Zy mo公司）說明用亞硫酸氫鈉修飾DNA，經(jīng)乙醇沉淀回收重懸于溶解液中。分別用甲基化（M）和非甲基化（U）兩種引物進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95℃變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后一次72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)總體系25μL，包括：Zy mo TaqTMPre Mix 12.5μL，正向引物（濃度20μmol／L）0.5μL，反向引物（20μmol／L）0.5 μL，DNA 2μL，dd H2O 9.5μL。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物，6×加樣緩沖液1μL，3.0% 瓊脂糖膠100 V電泳，UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相?？瞻讓?duì)照為不加DNA的dd H2O。

表1 P15INK 4B引物序列Tab 1 Pri mer sequences of P15 INK 4B

P15INK4B基因mRNA的檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光PCR （real-ti me fluorescent PCR）相對(duì)定量法，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各樣品的ΔCt（目的基因Ct值－GAPDH基因Ct值），以表達(dá)最低樣本作為校正樣品，計(jì)算RQ值，公式：RQ＝2－（樣品的ΔCt－校正品ΔCt）。引物由上海生工公司通過Pri mer 5.0軟件設(shè)計(jì)合成（表2）。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃30 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃滅活5 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。PCR反應(yīng)體系按照Ta Ka Ra公司說明書配制，2×SYBR Premix Ex Taq 10μL，Rox DyeⅡ0.4μL，正向引物0.4μL，反向引物0.4μL，c DNA 2μL，雙蒸水6.8μL。每一個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算平均值作為RQ值。

表2 P15 INK 4B和GAPDH引物序列Tab 2 Pri mer sequences of P15 INK 4B and GAPDH

細(xì)胞增殖的檢測(cè) 采用羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（carboxy fluorescein diacetate succini midyl ester，CFDASE，簡(jiǎn)稱CFSE）法。收集3組細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106／ml，按CFSE細(xì)胞增殖與示蹤檢測(cè)試劑盒（日本Dojindo公司）說明操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MFI。CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞后不可逆地與細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上。當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記的熒光平均分配至2個(gè)子代細(xì)胞中，其MFI是親代細(xì)胞的一半，隨傳代而衰減。

細(xì)胞早期凋亡的檢測(cè) 采用Annexin V-FITC單染法。收集3組細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106／ml，按Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司）說明操作，加入5μL Annexin V-FITC，室溫避光反應(yīng)20 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞周期的檢測(cè) 采用碘化丙啶（PI）單染法檢測(cè)細(xì)胞周期。收集3組細(xì)胞，PBS洗滌，加入預(yù)冷的70%乙醇（PBS配制），于4℃固定過夜，1 200 r／min離心5 min（離心半徑13.5cm），棄上清，PBS洗滌，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106／ml，取100μL，加入RN ase A酶，終濃度為1 mg／ml，混勻后37℃水浴30 min，加入PI綜合染液（美國 Molecular Pr obes公司），終濃度為50μg／ml，混勻，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞內(nèi)的LIP 與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組和FAC＋DFO組的LIP均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝10.60，P＜0.001；F＝41.79，P＝0.0485）；與FAC組相比，F(xiàn)AC＋DFO組的LIP明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.942，P＜0.0001）。說明FAC使SK M-1細(xì)胞鐵負(fù)荷增加，DFO則使鐵負(fù)荷下降（圖1、表3）。

圖1 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞內(nèi)LIPFig 1 Cellular LIP of different iron loading groups

表3 不同鐵負(fù)荷組的檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Detection results of different iron loading groups （±s）

表3 不同鐵負(fù)荷組的檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Detection results of different iron loading groups （±s）

Group LIP（%）ROS（MFI，%）mRNA（d R）Pr oliferation（MFI，%）Early apoptosis rate（%）Cell cycle（%）G1 S G2 Control 1.45±0.65 33.38±12.96 1 51.67±1.61 22.53±1.76 55.78±3.61 44.22±3.610 FAC 64.04±2.12 45.57±1.18 0.72±0.08 23.01±5.20 13.97±2.25 50.22±9.20 49.77±9.20 0 FAC＋DFO 8.34±4.21 34.39±2.12 1.50±0.15 37.34±6.61 55.07±1.30 51.10±6.30 48.90±6.300

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞內(nèi)的ROS 與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組的ROS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6.016，P＝0.0025）；FAC＋DFO組的ROS無明顯升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2.541，P＝0.764）。與FAC組相比，F(xiàn)AC＋DFO組的ROS明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝15.29，P＝0.0154）。說明隨著鐵負(fù)荷增減，細(xì)胞內(nèi)ROS水平也有所增減，DFO在使鐵負(fù)荷下降的同時(shí)，降低SK M-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平（圖2、表3）。

圖2 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞內(nèi)ROSFig 2 Cellular ROS of different iron loading groups

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的P15INK4B基因甲基化情況電泳圖顯示，對(duì)照組的SKM-1細(xì)胞呈現(xiàn)明顯甲基化，未出現(xiàn)非甲基化條帶；FAC組的甲基化條帶略淡，但未出現(xiàn)非甲基化條帶；FAC＋DFO組的甲基化條帶明顯變淡，并出現(xiàn)非甲基化條帶（圖3）。

圖3 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞P15INK 4B基因甲基化狀態(tài)電泳圖Fig 3 The electr ophotogram of P15INK 4B gene methylation state in different ir on loading groups

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的P15INK4B基因mRNA表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組的P15INK4B基因mRNA表達(dá)水平下降（F＝2.2 6 5，P＝0.0274），F(xiàn)AC＋DFO組的表達(dá)水平升高（F＝1.483，P＝0.0117），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明鐵過載抑制了P15INK4B基因的表達(dá)，而去鐵可使P15INK4B基因重新表達(dá)（圖4、表3）。

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的增殖情況 與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組和FAC＋DFO組CFSE的MFI均減少（F＝10.42，P＝0.0008；F＝16.84，P＝0.0218），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明兩組細(xì)胞均有增殖。但與FAC組相比，F(xiàn)AC＋DFO組CFSE的MFI升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1.617，P＝0.0419），說明加入DFO后部分抑制了鐵過載SKM-1細(xì)胞的增殖（圖5、表3）。

圖4 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞P15 INK 4B基因mRNA表達(dá)電泳圖Fig 4 The electrophotogram of P15 INK 4B gene mRNA expression in different iron loading groups

圖5 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞CFSE的MFIFig 5 MFI of CFSE in different iron loading groups

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的早期凋亡情況 與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組早期凋亡率減少（F＝1.628，P＝0.04），F(xiàn)AC＋DFO組早期凋亡率增加（F＝1.845，P＜0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與FAC組相比，F(xiàn)AC＋DFO組早期凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3.005，P＜0.001）。說明鐵負(fù)荷抑制SK M-1細(xì)胞的凋亡，而去鐵能促進(jìn)SK M-1細(xì)胞的凋亡（圖6、表3）。

圖6 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的早期凋亡率Fig 6 Early apoptosis rate in different iron loading groups

不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的細(xì)胞周期 與對(duì)照組相比，F(xiàn)AC組和FAC＋DFO組G1期細(xì)胞比例有下降，S期細(xì)胞比例有升高（F＝6.486，P＝0.386；F＝3.040，P＝0.326），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），說明鐵負(fù)荷對(duì)SK M-1細(xì)胞周期無明顯作用（圖7、表3）。

圖7 不同鐵負(fù)荷組細(xì)胞的細(xì)胞周期Fig 7 The cell cycle in different iron loading gr oups

討 論

近年來對(duì)MDS的診斷、分型和預(yù)后判斷有較大的進(jìn)展，而治療上或以支持治療為主，或借鑒A ML化療方案。直至2004年以后，由美國FDA批準(zhǔn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA met hyltransferase，DNMT）抑制劑阿扎胞苷（5-azacitidine，5-AZA，5-氮胞苷）和地西他濱 （5-aza-2′-deoxycytidine，Decitabine，DAC，5-氮雜-2′-脫氧胞苷）、新型口服鐵螯合劑地拉羅司（Deferasir ox，DFX）以及免疫調(diào)節(jié)劑雷利度胺（lenalidomide）陸續(xù)上市，才改變了長期以來MDS治療的無針對(duì)性狀況。P15INK4B基因高度甲基化是較早被證明存在于MDS中的表觀遺傳改變［10]，在初發(fā)以及疾病進(jìn)展中均可被檢測(cè)到，并且與轉(zhuǎn)化為白血病高度相關(guān)［2，11]。該異?？杀籇NMT抑制劑所逆轉(zhuǎn)，在DAC治療后，原本因高度甲基化而靜默的P15INK4B基因重新表達(dá)［12]。但是相比DNMT抑制劑的廣泛應(yīng)用以及對(duì)MDS抑癌基因去甲基化的密切關(guān)注和研究［13]，MDS的去鐵治療尚未得到很大的關(guān)注［5]。

研究發(fā)現(xiàn)，約80%的MDS患者早期表現(xiàn)為貧血，通過腸道代償性吸收過多的鐵以滿足造血需要，超過40%的患者最終進(jìn)展為輸血依賴［14]。因此，鐵過載在MDS患者中普遍存在。在MDS的預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞輸注依賴和鐵過載不僅導(dǎo)致器官損害，而且直接損害造血系統(tǒng)功能，對(duì)病程產(chǎn)生影響，因此 WHO在國際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)（IPSS）［15]中增加了貧血和紅細(xì)胞輸注依賴指標(biāo)，形成了WHO預(yù)后 評(píng)分系統(tǒng) （WPSS）［16]。Delgado 等［7]研 究 發(fā)現(xiàn)，去鐵治療可以提高DNMT抑制劑的療效。

本研究為避開MDS的異質(zhì)性，選用MDS細(xì)胞株SKM-1作為研究對(duì)象，參考文獻(xiàn)［17]，一方面，用FAC使SK M-1細(xì)胞LIP明顯升高，造成鐵過載，誘導(dǎo)ROS明顯升高，同時(shí)，抑癌基因P15INK4B的mRNA表達(dá)水平明顯下降，SK M-1細(xì)胞增殖明顯，凋亡受抑；另一方面，在SK M-1細(xì)胞鐵過載的基礎(chǔ)上，用臨床常用的鐵螯合劑DFO進(jìn)行去鐵，發(fā)現(xiàn)LIP明顯下降，ROS也隨之明顯降低，同時(shí)，抑癌基因P15INK4B的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，抑制了SK M-1細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了其凋亡。提示DFO可誘導(dǎo)鐵過載的SK M-1細(xì)胞P15INK4B基因去甲基化，使其重新表達(dá)，并可抑制鐵過載的SKM-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。臨床上可能與DNMT抑制劑有協(xié)同作用。

目前臨床上DNMT抑制劑有2種：5-AZA和DAC，鐵螯合劑有3種：DFO、去鐵酮（deferiprone，DFP）和DFX，在中國批準(zhǔn)用于MDS鐵過載治療的是DFO和DFX［18]。表觀遺傳學(xué)修飾治療和去鐵治療最近已被納入我國的 MDS治療專家共識(shí)［19]，正改善著MDS的自然病程和預(yù)后。本研究為表觀遺傳學(xué)修飾治療和去鐵治療協(xié)同應(yīng)用于MDS治療提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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