草地早熟禾根際磷細(xì)菌的分離與鑒定

梁凈 張曉波 趙艷 許沛冬

摘要：利用選擇性培養(yǎng)基從草地早熟禾（Poa pratensis）根際土壤中篩選到8株有機(jī)磷細(xì)菌和7株無機(jī)磷細(xì)菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)和生理生化等特性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明，有機(jī)磷細(xì)菌菌株P(guān)O1、PO3、PO4、PO5鑒定為Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌），菌株P(guān)O2、PO6和PO7鑒定為Bacillus megaterium（巨大芽孢桿菌），菌株P(guān)O8為Bacillus badius（栗褐芽孢桿菌），而本試驗(yàn)篩選到的無機(jī)磷細(xì)菌菌株均為Pseudomonas sp.（熒光假單胞菌）。

關(guān)鍵詞：草地早熟禾；磷細(xì)菌；分離；鑒定

中圖分類號： S688.406文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0314-03

收稿日期：2013-10-22

基金項(xiàng)目：海南省自然科學(xué)基金（編號：312060）。

作者簡介：梁凈（1991—），男，瑤族，主要從事草坪管理相關(guān)研究。E-mail：airstreet00@163.com。

通信作者：張曉波，博士，副教授。E-mail：angiaoo@126.com。磷是植物生長發(fā)育必需的重要營養(yǎng)元素，但我國目前土壤缺磷面積較大，增加土壤磷素的主要途徑依然是靠草地生產(chǎn)中施用的磷肥。由于施入可溶性的磷肥會使農(nóng)田大部分迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樽魑镫y以吸收的無效磷，最終導(dǎo)致作物對磷肥的當(dāng)季利用率很低[1-2]。對于我國而言，提取固定土壤中釋放的無效磷，對提高土壤可利用磷素含量、減少磷肥使用具有重要的意義[2]。磷細(xì)菌是可以將土壤中有機(jī)磷和難溶性無機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可溶性無機(jī)磷的細(xì)菌，可分為解磷菌（有機(jī)磷細(xì)菌）和溶磷菌（無機(jī)磷細(xì)菌）兩大類[3-5]。研究證明，土壤中存在大量微生物，能將植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)[6]，對于將無效磷轉(zhuǎn)變?yōu)橛行Я子兄陵P(guān)重要的作用。

草地早熟禾（Poa pratensis）是常用的冷季型草坪草，其綠期長、適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣，抗霜凍及耐寒能力強(qiáng)，對于北方城市草坪美化、綠化有重要意義。肥料的合理施用對其生長及發(fā)揮生態(tài)效益具有重要作用，其中磷肥對草坪草的重要作用主要表現(xiàn)在抗性方面[7-9]。我國目前磷礦資源貧乏，生產(chǎn)能力低，使用的磷肥主要依靠外國進(jìn)口，因此，研發(fā)生物磷肥，既可提高作物產(chǎn)量，又可保護(hù)土壤資源，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。根據(jù)生態(tài)學(xué)原理，特定種類的有益菌株，從原習(xí)居地取樣篩選，不僅能滿足植物的專一性，且能獲得較高成功率。本研究利用選擇培養(yǎng)基，從草地早熟禾根際土壤樣品中對磷細(xì)菌進(jìn)行分離、純化、鑒定，對于有效利用磷細(xì)菌菌株及調(diào)控植物根系微生物系統(tǒng)有重要意義，可為研制專用生物磷肥提供必要實(shí)踐及理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土樣基本特征草地早熟禾根際磷細(xì)菌土樣取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)年限為3年的健康草地早熟禾根際土壤，其pH值為8.24，有機(jī)質(zhì)含量為8.59 g/kg，全鉀為 3.18 g/kg，全磷為0.21 g/kg，全氮為0.17 g/kg，速效鉀為90.67 mg/kg，速效磷為60.37 mg/kg。

1.1.2培養(yǎng)基蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基[10-11]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，卵磷脂 0.2 g，CaCO3 1.0 g，酵母粉 0.5 g，瓊脂20 g，總體積1 000 mL（蒸餾水補(bǔ)足），pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

Pikovaskaias（PKO）無機(jī)培養(yǎng)基[10-11]：葡萄糖10.0 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.036 g，Ca3（PO4）2 2.0 g，瓊脂20 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，總體積1 000 mL（蒸餾水補(bǔ)足），pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基[12]：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl 8.0 g，瓊脂20 g，總體積 1 000 mL（蒸餾水補(bǔ)足），pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

土壤礦物：去除有機(jī)殘?bào)w的土壤，取土樣3 g，加入20% HCl 30 mL，煮沸30 min，過濾，用蒸溜水淋洗至無氯離子反應(yīng)。

1.2方法

1.2.1根際土壤的采集采樣區(qū)為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)健康的草地早熟禾草坪，取草坪區(qū)域良好處作為標(biāo)準(zhǔn)樣地（3 m×3 m），在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣地內(nèi)按“S”形隨機(jī)選擇5株草地早熟禾植株，先除去其表層的枯草及落葉，隨后將整個(gè)植株帶根系慢慢挖出，輕輕抖落根系上的大塊土壤，收集附于植株根系表面約2 mm左右的土壤，分別將采集到的根際土樣裝入經(jīng)過高壓消毒的無菌紙袋，并在袋上注明采集日期以及土樣號，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2磷細(xì)菌分離稱取各根際土壤樣品1 g，在無菌條件下操作，分別取9 mL無菌水和8粒無菌玻璃珠裝入 250 mL 的三角瓶中，置于恒溫振蕩機(jī)上25 ℃ 、170 r/min振蕩 20 min，得到10-1稀釋度的土壤懸液。用無菌吸管分別吸取10-1稀釋度的土壤懸液1 mL并注入裝有9 mL無菌水的三角瓶中作10-2稀釋度的土壤懸液，隨后再用無菌吸管吸取10-2稀釋度的土壤懸液1 mL并注入裝有9 mL無菌水的試管中作10-3稀釋度的土壤懸液，依此類推，分別得到10-4、10-5、10-6稀釋度的各土樣懸液。用移液管吸取上述稀釋度為10-4、10-5、10-6的各土壤懸液，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。稀釋平板法，有機(jī)磷細(xì)菌菌株于28 ℃下培養(yǎng) 24 h，無機(jī)磷細(xì)菌菌株在28 ℃下培養(yǎng)2～4 d，分別觀察其菌落形態(tài)。由于有機(jī)磷細(xì)菌能分解卵黃中的有機(jī)磷產(chǎn)生磷酸，無機(jī)磷細(xì)菌能分解磷酸鈣鹽產(chǎn)生有機(jī)酸或無機(jī)酸，使難溶性的磷酸鈣鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽，所以在其菌落的周圍可形成一個(gè)透明圈。挑選周圍產(chǎn)生透明圈的單菌落，接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，在LB平板上2次活化再接入牛肉膏蛋白胨斜面保存。

1.2.3磷細(xì)菌的形態(tài)及生理生化特性鑒定（1）革蘭氏染色：取用24 h菌齡的純培養(yǎng)物制片染色后通過鏡檢觀察其染色結(jié)果。（2）芽孢染色：采用淀粉銨鹽培養(yǎng)基[13]培養(yǎng) 3 d，用芽孢染色法[13]觀察其形狀及著生位置。（3）鞭毛染色：取連續(xù)傳代培養(yǎng)2次的菌種，接種至新鮮配制的瓊脂斜面上（有冷凝水），30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察硝酸銀染色的結(jié)果。（4）菌體大小測定：簡單染色后用數(shù)碼顯微鏡觀測菌體長及寬。（5）液體培養(yǎng)特征：將供試菌株接種在硅酸鹽細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫下培養(yǎng)6 d，觀察是否形成菌環(huán)、菌膜、渾濁或沉淀特征。（6）菌落特征：用接種環(huán)接菌，對制成的平板進(jìn)行劃線，置于30 ℃恒溫下培養(yǎng)5～6 d，觀察并且描述其菌落大小、顏色、形狀、是否黏稠、是否透明。（7） 過氧化氫酶試驗(yàn)：將供試菌株活化后（培養(yǎng)18～24 h），有機(jī)磷細(xì)菌菌株接種于蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基斜面上，無機(jī)磷細(xì)菌菌株接種于PKO無機(jī)培養(yǎng)基斜面上，分別置于30 ℃下培養(yǎng)，7 d 后，在豐滿的菌苔上滴加3% H2O2 1 mL，立即檢查其結(jié)果，5 min 內(nèi)如出現(xiàn)氣泡則為陽性反應(yīng)，記錄為“+”，否則為“ -”。（8） 其他生化性狀：甲基乙酰甲醇試驗(yàn)（V.P試驗(yàn)）、酪素水解、淀粉水解、產(chǎn)吲跺試驗(yàn)、卵磷脂酶、硝酸鹽還原試驗(yàn)等均按常用方法[14]進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的分離

用接種環(huán)取上述分離到的各類菌株的純培養(yǎng)物，再以平板劃線法將其分別接種于平板培養(yǎng)基上，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。視菌落生長情況，在蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基挑出8株有機(jī)磷細(xì)菌菌落，分別編號為PO1至PO8。在PKO培養(yǎng)基挑出7株無機(jī)磷細(xì)菌菌落，分別編號為PM1至PM7。然后對挑出的菌株進(jìn)一步分離純化后，對菌株的形態(tài)和生理生化特征進(jìn)行鑒定。

2.2菌株的培養(yǎng)特征

將分離純化得到的8株有機(jī)磷菌株和7株無機(jī)磷菌株，分別接種在分離培養(yǎng)基平板上30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷菌株（表1）在蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基上菌落形狀不一，主要呈現(xiàn)乳白色或淺黃色，像半粒玻璃珠平貼于平板上；菌落凸起呈圓形或不規(guī)則，邊緣完整或鋸齒狀，表面光滑，濕潤有光澤，黏稠，富有彈性。無機(jī)磷菌株（表2）在PKO培養(yǎng)基上形狀為圓形，呈現(xiàn)色澤不一，邊緣完整或鋸齒狀，表面光滑，濕潤有光澤，黏稠，富有彈性。在液體培養(yǎng)條件下，分離的菌株能在培養(yǎng)液底部形成透明度不一的霧狀沉淀，沉淀膠結(jié)成團(tuán)，不易搖散，培養(yǎng)液渾濁度不一。表1草地早熟禾根際有機(jī)磷細(xì)菌在蒙金娜有機(jī)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

菌株號形狀隆起度透明度邊緣顏色表面狀況生長速度PO1不規(guī)則凸起不透明鋸齒狀淺黃色較濕潤較慢PO2圓形凸起不透明完整白色濕潤較慢PO3不規(guī)則凸起不透明完整乳白很濕潤較快PO4不規(guī)則平坦不透明波浪狀淺黃色很濕潤較慢PO5不規(guī)則凸起稍透明完整乳白較濕潤較快PO6圓形平坦不透明波浪狀乳白較濕潤較快PO7圓形平坦不透明完整白色濕潤較慢PO8圓形凸起不透明鋸齒狀灰白色很濕潤較快

菌株號形狀隆起度透明度邊緣顏色表面狀況生長速度PM1圓形凸起不透明鋸齒狀乳白很濕潤較快PM2圓形平坦不透明鋸齒狀灰白色很濕潤較慢PM3圓形凸起透明完整乳白很濕潤較快PM4圓形平坦不透明完整淺黃色很濕潤較慢PM5圓形凸起稍透明完整乳白較干燥較快PM6圓形平坦透明齒狀無色較干燥較快PM7圓形平坦透明完整無色很濕潤較慢

2.3菌株的形態(tài)

2.4菌株的生理生化特征

2.5磷細(xì)菌的鑒定

3結(jié)論

目前微生物肥料的應(yīng)用與開發(fā)尚有許多不足，但此方面的研究對啟動(dòng)土壤磷庫資源、減少化肥的投入及環(huán)保等諸多方面具有深遠(yuǎn)的意義。本研究通過對8株有機(jī)磷菌株和7株無機(jī)磷菌株的細(xì)胞形態(tài)及生理生化特征的初步考察，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]及有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17- 19]，可以確定8株有機(jī)磷細(xì)菌中的PO1、PO3、PO4、PO5為Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌），PO2、PO6和PO7為Bacillus megaterium（巨大芽孢桿菌），PO8為Bacillus badius（栗褐芽孢桿菌），而7株無機(jī)磷菌株均為Pseudomonas sp.（熒光假單胞菌）。分析結(jié)果表明有機(jī)磷細(xì)菌菌株為芽孢桿菌屬，無機(jī)磷細(xì)菌為假單胞菌屬。通過此次研究可知山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)草地早熟禾根系常見的磷細(xì)菌種類，為將來更好地挖掘草地早熟禾微生物的解磷潛能，對開發(fā)高效微生物肥料，提高土壤中有效磷的含量、減少化學(xué)肥料的使用、改善土壤環(huán)境方面具有積極作用，對探索草地早熟禾根際土壤的潛在肥力、發(fā)展草地早熟禾土壤地可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有一定的理論與實(shí)際作用。關(guān)于各磷細(xì)菌菌株的解磷機(jī)制和在土壤中的活動(dòng)規(guī)律有待于進(jìn)一步研究。

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