補腎益髓生血法對苯與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)AA大鼠Th1/Th2細胞分泌細胞因子影響的實驗研究

張豐豐 趙宗江 張新雪 田 晨 吳志奎

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞與生化實驗室，北京，100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京，100053)

補腎益髓生血法對苯與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)AA大鼠Th1/Th2細胞分泌細胞因子影響的實驗研究

張豐豐1趙宗江1張新雪1田 晨1吳志奎2

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞與生化實驗室，北京，100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京，100053)

目的：探討補腎益髓生血法對苯與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)AA大鼠血清細胞因子的作用。方法：清潔級SD大鼠85只，隨機分為正常組10只，造模組75只，造模組皮下隔天注射苯(1 mL/kg)7周，取材前2周連續(xù)隔天腹腔注射CTX(25 mg/kg)3次，建立苯與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)AA大鼠模型。三周后灌胃前，按體質(zhì)量隨機分為模型組、康力龍組、益髓生血組、溫腎生血組和滋腎生血組。第七周處死大鼠，股動脈取血，靜置離心后，取上層血清，放免法檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10細胞因子的表達。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清IFN-γ明顯升高(P<0.05)，IL-2顯著升高(P<0.01)，TNF-α有升高趨勢，經(jīng)過治療后，IFN-γ、IL-2、TNF-α均有降低趨勢；與正常組比較，模型組IL-4、IL-5水平明顯降低(P<0.05)，IL-10顯著降低(P<0.01)，經(jīng)過治療后，IL-4、IL-5、IL-10均有升高趨勢。結(jié)論：補腎益髓生血法可降低AA大鼠血清細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α負(fù)調(diào)控，增加細胞因子IL-4、IL-5、IL-10正調(diào)控，對AA大鼠免疫和造血系統(tǒng)有一定的調(diào)節(jié)作用，且滋腎生血方療效優(yōu)于益髓生血顆粒、溫腎生血方。

再生障礙性貧血；補腎益髓生血法；血清細胞因子；SD大鼠

再生障礙性貧血(Aplastic Anemia，AA)中存在免疫系統(tǒng)紊亂，造血調(diào)控因子表達異常。AA大鼠免疫功能異常，細胞因子表達異常，CD4+T細胞中Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2、TNF-α負(fù)調(diào)控升高，Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-5、IL-10正調(diào)控降低，使Th0細胞向Th1/Th2細胞分化[1]。我們在建立苯與環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)AA大鼠模型的基礎(chǔ)上，探討補腎益髓生血法對AA大鼠Th1/Th2細胞分泌細胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠85只，健康，體質(zhì)量(250±20)g，購自北京華阜康生物科技有限公司(許可證編號：SCXK京2009-0007)。實驗動物飼養(yǎng)在潔凈級動物房置于潔凈動物櫥(YX-系列專利號EJ932041477北京文慧凈化設(shè)備廠)中，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，普通固體飼料進食，自由飲水。

1.2 藥物與試劑 苯(北京化工廠，產(chǎn)品批號：20110808)、環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號：20101103)；司坦唑醇片(廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司，產(chǎn)品批號：100820)；益髓生血顆粒(簡稱：益髓生血，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，產(chǎn)品批號：20110506)；溫腎益髓生血浸膏(簡稱：溫腎生血，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，批號：20110507)；滋腎益髓生血浸膏(簡稱：滋腎生血，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，產(chǎn)品批號：20110508)；水合氯醛(沈陽試劑廠，產(chǎn)品批號：820601)。

1.3 儀器 精密電子天平；微量加樣器；低溫高速離心機；低溫冰箱等。

2 實驗方法

2.1 AA大鼠模型的建立 85只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后按體質(zhì)量區(qū)段隨機分組為：正常組10只，造模組75只。根據(jù)兩次預(yù)實驗結(jié)果，造模組按1 mL/kg體質(zhì)量皮下隔天注射苯，注射7周；取材前10 d按25 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射3d。將造模組大鼠按體質(zhì)量隨機分為5組，分別為模型組、西藥組、益髓生血組、溫腎生血組、益髓生血組，各15只[1]。

2.2 給藥方法 AA大鼠造模3周后，按西藥組(2.8 mg/kg)、益髓生血組(3.5 g/kg)、溫腎生血組(3.5 g/kg)和滋腎生血組(3.5 g/kg)給予相應(yīng)藥物灌胃給藥，灌胃劑量按1 mL/100 g體質(zhì)量系數(shù)計算，每天1次，模型組和正常組大鼠給予等量去離子水灌胃，灌胃用藥4周。全部大鼠均分籠飼養(yǎng)，給予普通大鼠維持料及自來水自由飲食。

2.3 取材 治療4周后，各組大鼠分別采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉。經(jīng)股動脈取血入10 mL干凈離心管，靜置2 h后，低溫高速離心(4 ℃，2 000 r/min)20 min，抽取上層血清，-20 ℃保存，檢測相應(yīng)細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10。

3 實驗內(nèi)容

放免法檢測血清中細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10含量。

1)取聚乙烯試管編號，采用平衡法，按表1進行操作。

表1 試劑加樣表(μL)

2)混勻，室溫放置15 min后，3 500 r/min 4 ℃離心20 min，棄上清液，測沉淀cpm數(shù)。

3)計算結(jié)果，以N/T、B/T計算NSB、S0結(jié)合百分率，以B/B0計算標(biāo)準(zhǔn)及待測樣品結(jié)合百分率，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并查出樣品值，或由自動r計數(shù)儀預(yù)先編制程序。直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

4 結(jié)果

血清細胞因子檢測，與正常組相比，模型組IFN-γ、IL-2、TNF-α顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，各治療組IFN-γ、IL-2、TNF-α均顯著降低(P<0.01)；與正常組比較，模型組IL-4、IL-5、IL-10顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，各治療組IL-4、IL-5、IL-10均明顯升高(P<0.05，P<0.01)。具體見表2。

表2 補腎益髓生血法對AA大鼠血清IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10表達的影響

注：與正常組比較，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與益髓生血組比較，*P<0.05。

5 討論

AA發(fā)病機制極為復(fù)雜，有造血干細胞損傷、骨髓微環(huán)境異常、免疫功能異常等學(xué)說，近年來有學(xué)者認(rèn)為AA的病理機制主要是T細胞介導(dǎo)的免疫異常，造成造血干細胞大量凋亡引起造血功能損傷[2-3]。T淋巴細胞根據(jù)膜表面抗原分為CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞。大量實驗證明，再障患者CD3、CD4減少，CD8細胞數(shù)量相對增多，CD4/CD8比值降低，甚至倒置，Th1/Th2，Tc1/Tc2細胞比值升高，且活化的效應(yīng)細胞明顯增多[4-5]；約70%以上的原發(fā)和繼發(fā)性再障患者免疫功能異常在發(fā)病中起了重要作用，研究再障免疫機制對AA的研究具有重要的理論意義和實用價值[6]。

益髓生血顆粒是根據(jù)中醫(yī)的腎藏精生髓理論結(jié)合臨床實踐研制出的方藥，具有滋陰補腎、益髓生血、補氣健脾的功效，以補腎為主，兼以健脾養(yǎng)肝；在臨床治療AA上起到了重要的作用，益髓生血顆粒中山茱萸、何首烏為君，滋陰補腎[7]，意在補腎中真陰(真精)，益髓生精化血；熟地黃、補骨脂、炙黃芪、阿膠、黨參、當(dāng)歸為臣，其中熟地黃、補骨脂助君藥生精化血，加強補腎之功；補骨脂生發(fā)陽氣，取景岳“善補陰者，必陽中求陰”，炙黃芪、黨參補中益氣，阿膠滋陰補血，當(dāng)歸養(yǎng)血，四藥合用，益氣補血；雞血藤、鱉甲為佐藥，活血化瘀、軟堅散結(jié)；砂仁為使藥，以防滋膩；諸藥合用，以補腎為主，共奏滋補肝腎之陰、益氣補血、活血化瘀之功?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明益髓生血顆粒具有保護細胞膜增加免疫功能作用[8]。

溫腎生血方是在益髓生血顆粒的基礎(chǔ)上加入溫腎成分淫羊藿。中藥淫羊藿性辛溫味甘，具有補腎陽，強筋骨，祛風(fēng)濕的功效[9]。淫羊藿及其主要成分均能促進成骨細胞增殖，提高堿性磷酸酶活性，促進骨細胞形成[10]。研究表明，淫羊藿多糖確有拮抗免疫功能低下的作用，能提高機體的細胞免疫及體液免疫功能[11]。臨床和實驗研究證明，淫羊藿多糖在治療AA時可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，刺激骨髓造血和改善造血微環(huán)境[12]。溫腎生血方在益髓生血顆粒的基礎(chǔ)上加入淫羊藿，在治療AA時起到了加強溫腎助陽的作用。

滋腎生血方是在益髓生血顆粒的基礎(chǔ)上加入了滋腎成分女貞子。中藥女貞子是我國傳統(tǒng)的扶正固本藥物。具有養(yǎng)陰氣、平肝火、健腰膝、壯筋骨、滋補肝腎、烏須發(fā)等功效。大量研究表明，女貞子具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，促進造血的功能。用酒蒸和生女貞子的水煎劑均能提高小鼠脾、胸腺指數(shù)[13]。研究表明，女貞子醇提取液對T淋巴細胞、單核巨噬細胞具有促進作用；能消除惡性腫瘤患者抑制性T細胞的活性，女貞子在體內(nèi)對T細胞的促進作用，是通過增強細胞表面受體的活性來實現(xiàn)的[14-15]。同時，研究表明，女貞子醇提物和其有效成分齊墩果酸對環(huán)磷酰胺所致的白細胞降低有治療作用，女貞子還可以促進造血功能和有抗血小板的凝聚作用[16]。滋腎生血方在益髓生血顆粒的基礎(chǔ)上加入女貞子，在治療AA時起到了加強滋補腎陰的作用。

AA大鼠免疫功能異常，細胞因子表達異常，CD4+T細胞中Th1細胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2、TNF-α負(fù)調(diào)控升高，Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-5、IL-10正調(diào)控降低，使Th0細胞向Th1/Th2細胞分化。本實驗研究表明，AA大鼠外周血中，IFN-γ、IL-2、TNF-α升高，IL-4、IL-5、IL-10降低，經(jīng)過治療后，IFN-γ、IL-2、TNF-α均有降低，IL-4、IL-5、IL-10均有升高；AA存在免疫損傷及血清細胞因子的分泌失常。補腎益髓生血法能夠降低Th1細胞分泌細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α，增加Th2細胞分泌的細胞因子IL-4、IL-5、IL-10，在Th0細胞的分化過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。說明補腎益髓生血法可能通過調(diào)控AA免疫系統(tǒng)T細胞的調(diào)節(jié)作用，起到明顯的AA血液系統(tǒng)調(diào)節(jié)及延緩病程進展的作用。益髓生血顆粒通過益髓填精促進骨髓造血功能，溫腎生血方在益髓生血的基礎(chǔ)上增加了溫補腎氣的作用，而滋腎生血方在益髓生血的基礎(chǔ)上增加了滋腎陰的作用，益髓生血方、滋腎益髓生血方、溫陽益髓生血方三者對AA大鼠作用明顯，且滋腎益髓生血方療效更優(yōu)，說明補腎益髓生血法可以通過調(diào)控AA相關(guān)IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10，改善AA免疫功能，延緩AA的病程進展，其調(diào)節(jié)通路和機制，有待進一步研究證實。

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(2014-04-28收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

An Experimental Study of Th1/Th2 Cytokine Secretion of Tonifying Kidney，Benefiting Marrow and Engendering Blood Method to Cure AA Rats induced by Benzene and CTX

Zhang Fengfeng1，Zhao Zongjiang1，Zhang Xinxue1，Tian Chen1，Wu Zhikui2

(School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective：To explore the effect of tonifying kidney，benefiting marrow and engendering blood method on serum cytokines to cure rats with aplastic anemia (AA) induced by benzene and cyclophosphamide (CTX). Methods： Eighty five clean level SD rats were randomly divided into normal group (n=10) and other groups (n=75). Rats in the other groups were subcutaneously injected with benzene (1ml/kg) once every two days for 7 weeks，and given CTX (25mg/kg) 3 times every 2 days from sixth Monday for two weeks to establish AA model. Gavage began in the third week. Before that，rats were randomly divided into model group，the stanozolol group，benefiting marrow group，warming kidney group and nourishing kidney group according to weights，each group with 16 rats. The states and weights were recorded during the experiment. All the rats were killed in the seventh weekend. The level of IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10 in serum of AA rats were detected with radioimmunoassay. Results： Compared with the normal group，the level of IFN-γ and IL-2 in model group significantly increased (P<0.05 orP<0.01)，and the level of TNF-a in model group was with an increased trend. Compared with the model group，the level of IFN-γ，TNF-a and IL-2 in treatment groups were with a decreased trend. Compared with the normal group，the level of I L-4，IL-5 and IL-10 in model group significantly decreased (P<0.05 orP<0.01). Compared with the model group，the level of IL-4，IL-5 and IL-10 in treatment groups were with an increased trend. Conclusion： The tonifying kidney，benefiting marrow and engendering blood method can slow down the progression of AA by means of regulating the level of IFN-γ，TNF-a，IL-2，IL-4，IL-5，IL-10 in serum of AA rats，as analyzed，adjust immune system and reduce the immunologic injury. The nourishing kidney and engendering blood method is better than benefiting marrow and warming kidney method.

Aplastic anemia; Tonifying kidney，benefiting marrow and engendering blood method; Serum cytokines; Radioimmunoassay

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)——基于“腎藏精”的臟象理論基礎(chǔ)研究——從障礙性貧血探討“腎生髓”理論的研究(編號：2010CB530406)

張豐豐，女，研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治再生障礙性貧血機制的研究，E-mail：zhangfengzhun@163.com

趙宗江，男，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，郵編：100029，電話：(010)64286988，E-mail：zongjiangz@sina.com

R556.5;R242;R392.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.06.006