薄層色譜法鑒定芙蓉散中的主要成分

趙偉峰 車曉平 錢 珊 周明學(xué) 曾祖平

(1北京市中醫(yī)研究所，北京，100010;2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010;3北京中醫(yī)藥大學(xué)東方學(xué)院09級(jí)，廊坊，065001)

芙蓉散為北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑法定制劑，收載于《醫(yī)療單位制劑規(guī)程》中，主要成分有芙蓉葉、生大黃、黃連、關(guān)黃柏、澤蘭、黃芩、冰片，具有清熱解毒、消腫止痛之功效。用于瘡瘍腫毒，紅腫作痛，癥見紅、腫、熱、痛。舌紅、苔白、脈數(shù);乳腺炎、各種軟組織損傷、關(guān)節(jié)炎見上述證候者[1]。方中芙蓉葉有涼血解毒、消腫止痛作用，生大黃清熱解毒、祛瘀生新，在方中芙蓉葉、生大黃共為君藥解毒消腫;黃連、黃芩、黃柏清熱解毒，燥濕消炎，助君藥清熱解毒，在方中行臣藥的功能;澤蘭活血行水為佐藥;冰片化腐生肌，清熱涼血，行使藥之功。

芙蓉散作為外用藥，使用時(shí)用黃酒調(diào)成稀糊外敷或用凡士林制成軟膏，涂敷患處;同時(shí)也作為原料藥，用于制備芙蓉軟膏，在北京中醫(yī)醫(yī)院皮外科廣泛使用[2]。作為法定制劑，芙蓉散和芙蓉膏在北京市多家醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用多年，但一直以來只用簡單的試管反應(yīng)控制制劑質(zhì)量，缺乏專屬性強(qiáng)的鑒別手段。為了保證臨床療效，控制制劑質(zhì)量，本研究采用薄層色譜法對(duì)芙蓉散處方中主要藥味進(jìn)行鑒別。

1 儀器、試藥和樣品

1.1 儀器 AJ150L電子精密天平(上海梅特勒－托利多儀器有限公司)，SK7210HP型KUDOS超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，YOKO－ZS紫外線分析攝影儀(武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司)。

1.2 飲片 芙蓉散處方飲片由北京杏林藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。經(jīng)鑒定，芙蓉葉符合《北京市中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》2008版“芙蓉葉”項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定;其余飲片均符合《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2010年版(一部)各項(xiàng)下的質(zhì)量要求。

1.3 試藥 熊果酸(110742－200516，中國藥品生物制品檢定所)，掌葉大黃對(duì)照藥材(120904－200914，中國藥品生物制品檢定所)，黃連對(duì)照藥材(913－9905，中國藥品生物制品檢定所)，黃芩對(duì)照藥材(120955－200607，中國藥品生物制品檢定所)，關(guān)黃柏對(duì)照藥材(120937－200506，中國藥品生物制品檢定所)。

硅膠 G預(yù)制板(20110508，青島海洋化工廠分廠);聚酰胺薄膜;所用試劑均為分析純(北京化學(xué)試劑公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)樣品 芙蓉散(20110929，20120107，20120710，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院)。

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃的鑒別[3]取芙蓉散2 g，加乙醚20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。稱取除大黃外的處方其他飲片，照供試品溶液制備方法制備大黃陰性對(duì)照液。另取掌葉大黃對(duì)照藥材0.1 g，加乙醚20 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL溶解，作為大黃陽性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版(一部)附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、大黃陰性對(duì)照液各10 μL、大黃陽性對(duì)照溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G預(yù)制板上，以甲酸乙酯－石油醚(30－60℃)－甲酸(5∶15∶1)溶液分層后的上層為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm的紫外燈下檢視。供試品色譜與大黃陽性對(duì)照有對(duì)應(yīng)的橙色熒光斑點(diǎn);陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

圖1 大黃薄層色譜圖

圖2 黃芩薄層色譜圖

2.2 黃芩的鑒別[3－4]上述1中乙醚提取后的殘?jiān)鼡]盡溶劑，加乙酸乙酯與甲醇按3∶1比例混合的溶液20 mL，超聲提取20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。稱取除黃芩的處方其他飲片，照供試品溶液制備方法制備黃芩陰性對(duì)照液。另取黃芩對(duì)照藥材1 g，加上述混合溶液30 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為黃芩陽性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版(一部)附錄附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、黃芩陰性對(duì)照液各10 μL、黃芩陽性對(duì)照溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(5∶3∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置365 nm的紫外燈下檢視。供試品色譜與黃芩陽性對(duì)照色譜有對(duì)應(yīng)的暗色斑點(diǎn);陰性對(duì)照無干擾，見圖2。

2.3 黃連的鑒別[3，5－6]稱取除黃連外的處方其他飲片，照上述2中供試品溶液制備方法制備黃連陰性對(duì)照液。另取黃連對(duì)照藥材0.1 g，加甲醇5 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液作為黃連陽性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版(一部)附錄附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述2中供試品溶液、黃連陰性對(duì)照液各5 μL、黃連陽性對(duì)照溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G預(yù)制板上，以乙酸乙酯－環(huán)己烷－異丙醇－甲醇－三乙胺－ 水(3.5∶3∶1∶1.5∶1∶0.5)為展開劑，展開缸另一側(cè)加入等體積的濃氨試液，預(yù)平衡20 min，展開，取出，晾干，置365nm的紫外光燈下檢視。供試品色譜與黃連陽性對(duì)照有對(duì)應(yīng)的亮黃色熒光斑點(diǎn);陰性對(duì)照無干擾，見圖3。

圖3 黃連薄層色譜圖

2.4 關(guān)黃柏的鑒別[3]稱取除關(guān)黃柏外的處方其他飲片，照上述2中供試品溶液制備方法制備關(guān)黃柏陰性對(duì)照液。另取關(guān)黃柏對(duì)照藥材0.2 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為關(guān)黃柏陽性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版(一部)附錄附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述2中供試品溶液、黃柏陰性對(duì)照液各10 μL、關(guān)黃柏陽性對(duì)照溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G預(yù)制板上，以環(huán)己烷－甲苯－乙酸乙酯(3∶3∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜與關(guān)黃柏陽性對(duì)照有對(duì)應(yīng)斑點(diǎn);陰性對(duì)照無干擾，見圖4。

圖4 關(guān)黃柏薄層色譜圖

2.5 熊果酸的鑒別[3，7－8]稱取除澤蘭的處方其他飲片，照上述2中供試品溶液制備方法制備澤蘭陰性對(duì)照液。另取熊果酸對(duì)照品，加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版(一部)附錄附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述(2)中供試品溶液、澤蘭陰性對(duì)照液各10 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G預(yù)制板上，以環(huán)己烷－丙酮－乙酸乙酯(5∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365nm的紫外光燈下檢視。供試品色譜與對(duì)照品色譜有對(duì)應(yīng)的相同顏色的熒光斑點(diǎn);陰性對(duì)照無干擾，見圖5。

圖5 澤蘭薄層色譜圖

3 討論

1)鑒別黃芩時(shí)，首先嘗試藥典收載的色譜條件，結(jié)果層析效果不佳;經(jīng)過摸索，調(diào)整展開劑比例為甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(5∶3∶1∶2)，供試品色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾。

2)鑒別黃連、關(guān)黃柏時(shí)，考慮到二者均含有生物堿類成分，其中小檗堿和巴馬汀為二者共有成分，而黃連還含有其他生物堿成分如表小檗堿、黃連堿;若將黃連、關(guān)黃柏合并鑒別，則對(duì)關(guān)黃柏的薄層鑒別會(huì)產(chǎn)生干擾，無法體現(xiàn)關(guān)黃柏的存在。因此，本研究中黃連的鑒別是針對(duì)其特有的生物堿類成分表小檗堿、黃連堿，而關(guān)黃柏的鑒別是針對(duì)其含有的黃柏酮。關(guān)黃柏的鑒別是參考藥典中鑒別黃柏酮的方法進(jìn)行的。

3)藥材芙蓉葉《中國藥典》中未收載。研究中采用乙醇提取藥材并制備芙蓉葉陰性;根據(jù)文獻(xiàn)[9]曾經(jīng)針對(duì)芙蓉葉中的蘆丁等黃酮類成分進(jìn)行了薄層層析鑒別，但陰性對(duì)照有干擾，高效液相色譜也顯示陰性對(duì)照液中含有蘆丁，與澤蘭中含有蘆丁成分的文獻(xiàn)記載相符[10];也曾嘗試鑒別芙蓉葉中的其他弱極性成分，多次改變供試液制備方法、柱層析除雜及變換展開劑種類等，結(jié)果陰性對(duì)照仍有干擾，故放棄。

4)冰片在芙蓉散中所占比例很小(0.4%)。曾經(jīng)按藥典方法鑒別，結(jié)果供試品色譜與對(duì)照藥材色譜無明顯對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，故放棄。

5)現(xiàn)代藥理研究顯示，芙蓉散對(duì)角叉菜膠引起的大鼠足跖腫脹和醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高具有顯著抑制作用，能夠抑制和滅活常見淺表感染致病菌，表明芙蓉散具有抗炎消腫作用[11]。處方中黃連、關(guān)黃柏中主要藥效成分為生物堿類，具有顯著的抗菌、抗炎、抗病毒作用[12];黃芩中有效成分為黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理研究證明具有明顯的抗菌、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗致癌和抗病毒等作用[13];大黃主要化學(xué)成分為蒽醌衍生物，其中游離型蒽醌衍生物主要有大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚和大黃酚，是大黃中主要的抗菌成分[14];澤蘭中含有的熊果酸具有抗病毒和抗菌作用，也是芙蓉散中的藥效成分[15]。因此，本研究制定的芙蓉散質(zhì)量控制方法可以有效地鑒別芙蓉散中的藥效成分，從而保證臨床療效。

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