莪術(shù)油對(duì)人乳頭狀瘤病毒的抑制作用

張小燕，丁曉萍，葉 梅,徐海燕，卞美璐，陳慶云

莪術(shù)油對(duì)人乳頭狀瘤病毒的抑制作用

張小燕1，丁曉萍1，葉 梅1,徐海燕1，卞美璐2，陳慶云2

目的探討莪術(shù)油對(duì)人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16亞型的抑制作用。方法以不同濃度的含莪術(shù)油培養(yǎng)液體外培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞系SiHa、CaSki 和宮頸永生化細(xì)胞H8，相差顯微鏡下觀察活細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度莪術(shù)油對(duì)細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒HPV16亞型 E6E7的表達(dá)。結(jié)果不同濃度的莪術(shù)油可以抑制細(xì)胞的增殖；莪術(shù)油作用于SiHa細(xì)胞，G1期細(xì)胞減少(P<0.05)，G2、S期細(xì)胞增加(P<0.01)，細(xì)胞阻滯于G2、S期。莪術(shù)油作用于CaSki 、H8細(xì)胞，G1期細(xì)胞減少(P<0.01)，S期細(xì)胞增加(P<0.01)，使細(xì)胞阻滯于S期。加藥組SiHa、CaSki和H8細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.01，P<0.05)；三種細(xì)胞HPV16E6E7基因片段mRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論莪術(shù)油在體外抑制宮頸癌細(xì)胞系SiHa、CaSki 和宮頸永生化細(xì)胞H8增殖，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制HPV16E6E7表達(dá)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

莪術(shù)油；人乳頭狀瘤病毒；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

宮頸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前已經(jīng)明確高危型人乳頭狀瘤病毒感染是宮頸癌和癌前病變的主要危險(xiǎn)因素[1]，與宮頸癌有關(guān)的高危HPV亞型的治療目前尚無(wú)特效藥物，HPV疫苗大規(guī)模投入臨床使用尚需時(shí)日，研制開(kāi)發(fā)抗HPV藥物對(duì)于宮頸癌的防治具有重要意義。莪術(shù)屬姜科植物的干燥根莖，經(jīng)溫莪術(shù)蒸餾得到的揮發(fā)油-莪術(shù)油在抗病毒和腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的效果，故受到關(guān)注[2,3]。但是，莪術(shù)油對(duì)于宮頸病變相關(guān)的高危型HPV作用的研究報(bào)道甚少。本研究旨在探討中藥莪術(shù)油對(duì)于HPV16抑制作用的機(jī)制，為臨床對(duì)宮頸癌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 細(xì)胞系 CaSki細(xì)胞系,HPV16陽(yáng)性的人宮頸癌細(xì)胞株，H8細(xì)胞系，人宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞系，HPV16 陽(yáng)性細(xì)胞株，SiHa細(xì)胞系，HPV16 陽(yáng)性細(xì)胞株，以上均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物物理室提供。

1.1.2 引物 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司應(yīng)用美國(guó)PE公司391型 DNA自動(dòng)合成儀合成。

1.1.3 試劑 莪術(shù)油，由海南碧凱藥業(yè)有限公司提供；培養(yǎng)液和血清：Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)液(GIBCO BRL)，胎牛血清(天津市川頁(yè)生化制品有限公司)；工具酶：Taq DNA 聚合酶(Promega)，反轉(zhuǎn)錄酶(AMV Reverse Transcriptase)(Promega)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CaSki和SiHa細(xì)胞在含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，H8細(xì)胞在含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃， 5% CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于預(yù)先放置玻片的6孔板培養(yǎng)板內(nèi)，每孔10×104個(gè)細(xì)胞，分為4個(gè)組(對(duì)照組，藥物1-3組，藥物濃度分別為15、25、35 μg/ml),形成附有細(xì)胞的蓋片，培養(yǎng)3 d后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況 將細(xì)胞接種于六板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3000個(gè)細(xì)胞，第2天更換為含藥培養(yǎng)液，分4組，方法同上，每個(gè)濃度平行5孔。37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg/ml四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl, 37 ℃培養(yǎng)20 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)492 nm，連續(xù)6 d，記錄生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 在六孔培養(yǎng)板中以含不同濃度藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，分4組，方法同上，每個(gè)藥物濃度平行3孔，收集細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，PBS清洗2次，預(yù)冷70%乙醇固定，4℃保存待檢。經(jīng)0.01%RNA酶處理胞漿RNA、50 μg/ml碘化丙錠(propidium iodide, PI)DNA染色30 min后，經(jīng)300篩目過(guò)濾除去成團(tuán)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期中不同時(shí)相的細(xì)胞百分比和細(xì)胞凋亡率。每份標(biāo)本測(cè)定5000個(gè)細(xì)胞。根據(jù)DNA含量區(qū)分細(xì)胞所處細(xì)胞周期時(shí)相。

1.2.5 mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集培養(yǎng)第5天的細(xì)胞，TRIZOL處理后提取RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增HPV16E6、E7，同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參照，HPV16E6、E7引物(616 bp)：上游5′-TGACTTTGCTTTTCGGGATT-3′,下游5′-GAGAACAGATGGGGCACAC-3′。β-actin(552 bp)引物序列：上游：5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′,下游：5′-CATGGTGGTGCCGCCGCCAGACAG-3′。擴(kuò)增參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸加時(shí)5 min；PCR產(chǎn)物4 ℃保存； 2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，電壓40 V。應(yīng)用Scion Image 4.0 (NIH)軟件進(jìn)行電泳條帶圖像灰度值的半定量分析。待測(cè)基因電泳條帶灰度比值=待測(cè)條帶灰度值/同一份標(biāo)本內(nèi)參照β-actin條帶灰度值。每個(gè)加藥樣本至少檢測(cè)3次。

2 結(jié) 果

2.1 莪術(shù)油對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)， SiHa在莪術(shù)油作用第1天開(kāi)始，不同藥物濃度與空白對(duì)照吸光度值(OD)有顯著性差異(P<0.01)，并呈劑量依賴性(圖1)。H8與SiHa相似。而CaSki在藥物作用第2天開(kāi)始，不同藥物濃度與空白對(duì)照吸光度值(OD)差異有顯著性(P<0.01)，并呈劑量依賴性。計(jì)算莪術(shù)油作用第5天SiHa、H8、CaSki 50%抑制濃度(IC50)分別為25.6、31.4、33.8 μg/ml，其中SiHa對(duì)藥物的敏感性最高。

圖1 莪術(shù)油作用下各組SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 SiHa細(xì)胞用莪術(shù)油處理后，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，部分細(xì)胞固縮(圖2，3)。莪術(shù)油對(duì)CaSki 和H8細(xì)胞也有相似作用。

2.3 莪術(shù)油作用下細(xì)胞周期和凋亡率 莪術(shù)油作用于SiHa細(xì)胞，G1期細(xì)胞減少(P<0.05)，G2、S期細(xì)胞增加(P<0.01)，細(xì)胞阻滯于G2、S期。莪術(shù)油作用于CaSki、H8細(xì)胞，G1期細(xì)胞減少，(P<0.01)，S期細(xì)胞增加(P<0.01)，使細(xì)胞阻滯于S期。在莪術(shù)油作用下，SiHa、 CaSki和H8細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.01，P<0.05，表1)。

圖2 SiHa細(xì)胞對(duì)照組(HE，×200)

2.4 莪術(shù)油對(duì)HPV E6E7基因表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)中在不同濃度莪術(shù)油作用下，SiHa、CaSKi、H8 HPV16E6E7基因片段mRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，并呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01，表2，圖4-6)。

圖3 SiHa細(xì)胞加藥組(35 μg/ml)(HE，×200)

表1 莪術(shù)油作用下細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05,②P<0.01；藥物1-3組，藥物濃度分別為15、25、35 μg/ml

表2 RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶灰度值 ；n=3)

注：藥物1-3組，藥物濃度分別為15、25、35 μg/mL

圖4 不同濃度莪術(shù)油作用下SiHa細(xì)胞系HPV16E6E7表達(dá)

圖5 不同濃度莪術(shù)油作用下CaSKi細(xì)胞系HPV16E6E7表達(dá)

圖6 不同濃度莪術(shù)油作用下H8細(xì)胞系HPV16E6E7表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)，從中藥中篩選抗病毒和抗腫瘤藥物是藥物治療研究的熱點(diǎn)。莪術(shù)油是經(jīng)溫莪術(shù)蒸汽蒸餾得到的揮發(fā)油，含有多種抗癌有效成分，如β-欖香烯、莪術(shù)醇、莪術(shù)酮、吉瑪酮等，在中藥復(fù)方中多有配用。中藥制劑保婦康栓由莪術(shù)油和冰片兩味中藥組成，在體外抑制宮頸癌細(xì)胞系CaSki 和宮頸永生化細(xì)胞H8增殖[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究莪術(shù)油對(duì)于體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞系和宮頸永生化細(xì)胞的作用，探討中藥在抗HPV中的作用。

H8細(xì)胞系是HPV16陽(yáng)性的宮頸永生化細(xì)胞系，可以作為宮頸癌前病變的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚5]，而SiHa、CaSki是HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞系，均為常見(jiàn)的人宮頸病變體外研究模型。莪術(shù)油對(duì)于SiHa、CaSki和H8細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)?；罴?xì)胞照像提示莪術(shù)油可以殺傷細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏，崩解破碎，證實(shí)藥物對(duì)三種細(xì)胞增殖有抑制作用。其中HPV16陽(yáng)性的SiHa細(xì)胞對(duì)莪術(shù)油的敏感性最高。

凋亡異常是腫瘤形成和進(jìn)展的重要原因，通過(guò)各種途徑和方式誘導(dǎo)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的凋亡，是抑制殺傷腫瘤細(xì)胞的重要方面。與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系的基因有Bcl-2、Fas/FasL、caspases等。Bcl-2是凋亡抑制基因，一旦細(xì)胞受到凋亡因子的誘導(dǎo)，Bcl-2向線粒體轉(zhuǎn)位通過(guò)寡聚化在線粒體外膜形成跨膜通道，或開(kāi)啟線粒體PT孔，導(dǎo)致線粒體中的凋亡因子釋放，激活caspase，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6,7]。Fas及其配體FasL是腫瘤壞死因子受體的超家族成員，F(xiàn)as和FasL被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，APpl·791-系統(tǒng)誘導(dǎo)的凋亡過(guò)程是通過(guò)Bcl-2表達(dá)的負(fù)調(diào)控Fas來(lái)實(shí)現(xiàn)的[8]。Fas蛋白與FasL結(jié)合后激活caspase，啟動(dòng)caspases的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。在HSC細(xì)胞凋亡過(guò)程中caspase家族起著重要作用，其中caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的不可替代的終末剪切酶，在凋亡的早期階段，細(xì)胞色素C從線粒體釋放，繼而伴caspases激活，活化的caspase-3被裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物而激活核酸酶，從而降解DNA，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。國(guó)艷等[10]發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)油注射液對(duì)體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞有明顯促凋亡作用，可能是通過(guò)上調(diào)促凋亡基因Fas/FasL的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，使線粒體通透性增加，鏈鎖激活caslyase-3蛋白，而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在不同濃度的莪術(shù)油作用下，SiHa、 CaSki和H8細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組。另外，在莪術(shù)油作用下，SiHa細(xì)胞阻滯于G2、S期，CaSki 和H8細(xì)胞則阻滯于S期，表明莪術(shù)油可以通過(guò)影響DNA的合成和復(fù)制，有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究證實(shí)莪術(shù)油的成分姜黃素、欖香烯對(duì)腫瘤細(xì)胞的各個(gè)周期都有抑制作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)中，在莪術(shù)油作用下，SiHa、CaSki、H8三種細(xì)胞系HPV16E6E7基因片段mRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，且存在劑量依賴關(guān)系。莪術(shù)油可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞HPV16E6E7表達(dá)，激活P53和Rb通路促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡。

莪術(shù)油在體外抑制宮頸癌細(xì)胞系SiHa、CaSki 和宮頸永生化細(xì)胞H8增殖，因此莪術(shù)油可能是抑制HPV的有效中藥，對(duì)于明確為感染性疾病的宮頸癌的防治具有重大的意義，但是其作用機(jī)制及臨床療效尚有待進(jìn)一步探討。

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(2013-07-15收稿 2013-09-22修回)

(責(zé)任編輯 梁秋野)

Mechanismofproliferativeinhibitionofoleumcurcumaeonhumanpapillomavirusinvitro

ZHANG Xiaoyan1, DING Xiaoping1, YE Mei1，XU Haiyan1, BIAN Meilu2, and Chen Qingyun2.
1. Department of Obstetrics and Gynecology, The Second Artillery General Hospital of PLA, Beijing100088, China; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, China-Japan Friendship Hospital, Beijing100029, China

ObjectiveTo study the inhibition of HPV16 by oleum curcumae.MethodsThe human cervical cancer cell line-CaSki, SiHa and the immortalized cervical epithelial cell-H8 were cultured with different concentrations of oleum curcumae. Changes in cellular form were observed by phase contrast microscopy. The proliferative inhibition under different concentrations of oleum curcumae on CaSki, SiHa and H8 was measured by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay and flow cytometry assay. The mRNA expression of HPV16 E6E7 was determined by RT-PCR semi-quantitatively.ResultsThe growth of CaSki, SiHa and H8 was inhibited by different concentrations of oleum curcumae. SiHa cells were accumulated in G2, S phase(P<0.01), while CaSki, H8 cells were accumulated in S phase (P<0.01). The apoptosis rates in CaSki, SiHa and H8 cells were higher than those in control group(P<0.01，P<0.01，P<0.05). After treated by oleum curcumae, CaSki, SiHa and H8 cell showed decreased level of HPV16 E6E7 mRNA than that in the control group (P<0.01).ConclusionsOleum curcumae may execute its antiHPV activity primarily by decreasing the expression of HPV 16E6E7 in cervical cancer cell line and immortalized cervical epithelial cells.

oleum curcumae; human papillomavirus; reverse transcriptase polymerase chain reaction

張小燕，博士，副主任醫(yī)師，E-mail: xiehe2003@sina.com.cn

1. 100088北京，解放軍第二炮兵總醫(yī)院婦產(chǎn)科；2. 100029北京，衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院婦產(chǎn)科

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