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      淫羊藿內(nèi)生真菌的分離及抑菌活性研究

      2014-07-16 07:27:06易萌等
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年3期
      關(guān)鍵詞:內(nèi)生真菌抑菌活性

      易萌等

      摘要:從淫羊藿根、莖、葉分離出23株內(nèi)生真菌,對(duì)分離出的真菌利用瓊脂塊法進(jìn)行初選與濾紙片法進(jìn)行復(fù)選,并以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、灰霉病菌(Botrytis cinerea) 4 種微生物為指示菌對(duì)分離到的內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),分離得到的內(nèi)生真菌中有10株菌株具較好的抑菌活性。對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好的為標(biāo)號(hào)K7的菌株,抑菌圈直徑為18.0 mm;對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果最好的均為標(biāo)號(hào)B3的菌株,其抑菌圈直徑分別為18.0、15.0 mm;而對(duì)灰霉病菌抑菌效果最好的為標(biāo)號(hào)K6的菌株,其抑菌圈直徑達(dá)到12.0 mm。

      關(guān)鍵詞:淫羊藿;內(nèi)生真菌;抑菌活性

      中圖分類號(hào):S482.2+92;Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002-1302(2014)03-0327-03

      淫羊藿,為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鮮淫羊藿等多種淫羊藿的莖葉[1],主產(chǎn)于貴州、遼寧等省[2-3],夏、秋季采收,割取莖葉,除去雜質(zhì),曬干。淫羊藿莖葉含有淫羊藿苷和揮發(fā)油。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為淫羊藿性味辛甘、溫,有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕的功效;同時(shí),淫羊藿還可以抑制血管運(yùn)動(dòng)中樞,擴(kuò)張周圍血管,使血壓下降,對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等有顯著的抑制作用。淫羊藿在臨床上主要用于治療生殖、骨關(guān)節(jié)、呼吸系統(tǒng)疾病[4-5]。

      植物內(nèi)生真菌(endophyte fungus)是指在健康植物寄生的、在各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中進(jìn)行部分或全部生活周期而不使宿主表現(xiàn)明顯病理癥狀的一類真菌[6]。有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌普遍存在于植物組織內(nèi),并和宿主植物長(zhǎng)期共生,與宿主在遺傳、生理、代謝等方面相互滲透、同步進(jìn)化,形成互利互惠的共生關(guān)系,使得它極有可能與宿主交換遺傳信息,從而產(chǎn)生相似或相同生理活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]。1993年Stierle等從短葉紅豆杉內(nèi)生真菌中分離得到紫杉醇后,國(guó)內(nèi)外學(xué)者從多種藥用植物中陸續(xù)分離得到產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌[6,8],因此具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用植物內(nèi)生真菌已成為篩選新藥物的潛在資源[9-12]。

      本試驗(yàn)以貴州省貴陽(yáng)市郊的野生淫羊藿(Epimedium)為材料進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離,并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行初步研究,以獲得產(chǎn)生生物活性次生代謝產(chǎn)物的藥用微生物,進(jìn)而為新型抗菌物質(zhì)的獲得開辟一條新路徑。

      1 材料與方法

      1.1 樣品采集與內(nèi)生真菌的分離

      淫羊藿樣品采自貴州省貴陽(yáng)市郊。采集的新鮮植物樣品4 ℃保存,72 h內(nèi)處理。

      1.2 供試指示菌

      金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、灰霉病菌(Botrytis cinerea),均由貴州師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

      1.3 試驗(yàn)流程

      淫羊藿內(nèi)生真菌分離及抑菌活性試驗(yàn)流程見圖1。

      1.4 內(nèi)生真菌的分離、純化

      將采集的新鮮樣品用自來水洗凈泥土等臟物,根、莖、葉分別切為0.5 cm的小片。在無(wú)菌條件下,對(duì)樣本進(jìn)行表面消毒,具體步驟如下:無(wú)菌水沖3次,Tween-20 處理30 s,8%次氯酸鈉溶液消毒5 min,無(wú)菌水沖洗3 次,75%乙醇浸泡5 min,無(wú)菌水洗滌3次。同樣無(wú)菌條件下將樣本切成0.2 cm×0.2 cm 大小接種于PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)至出現(xiàn)菌落,從菌落邊緣取菌絲分別接種于新鮮平板,經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接得到純化菌株,保藏待用[13]。

      1.5 指示菌的培養(yǎng)

      將枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的單菌落接種于5 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18 h,將金黃色葡萄球菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基,用無(wú)菌水制備濃度約為 2.2×105 CFU/mL 的菌懸液,灰霉病菌在PDB培養(yǎng)基里 28 ℃ 搖床振蕩3 d,取100 μL 菌懸液接種于PDA固體培養(yǎng)基上,用玻璃環(huán)涂抹,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

      1.6 抗菌活性菌株的初選

      采用瓊脂塊法對(duì)所分離得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性的初選,具體步驟如下:用打孔器從在PDA平板上生長(zhǎng)的菌落上截取直徑為6.0 mm的瓊脂塊,用無(wú)菌鑷子將瓊脂塊放置于涂有指示菌的PDA平板上,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察及測(cè)量抑菌圈直徑[14],重復(fù)3次。

      1.7 抗菌活性菌株的復(fù)選

      檢測(cè)活性菌株發(fā)酵液的抑菌活性,作為活性菌株的復(fù)選方法,具體步驟如下:將初選菌株接種于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中,28 ℃搖床培養(yǎng)8 d,4 000 r/min 離心15 min,收集上清,過濾除菌,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將90 mL發(fā)酵液縮至1 mL。將紙片放在涂有指示菌的PDA平板上,點(diǎn)入20 μL發(fā)酵液在紙片上,28 ℃培養(yǎng)3 d,觀察并測(cè)量抑菌圈的直徑。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 淫羊藿內(nèi)生真菌分離結(jié)果

      采用組織分離法從淫羊藿葉、莖、根中共分離得到23株菌落形態(tài)特征有差異的內(nèi)生真菌,其中A類菌株有6株,B類有10株,K類有7株,試驗(yàn)部分菌株形態(tài)見圖2,其生態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定還有待研究。

      2.2 淫羊藿內(nèi)生真菌抑菌活性初步測(cè)定

      用瓊脂塊法從23株內(nèi)生真菌中初選抗菌活性較強(qiáng)的菌株。結(jié)果表明,A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株內(nèi)生真菌對(duì)大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和灰霉病菌均有一定的抑菌活性(表1)。

      由表1可知,對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好的是K6、K7,抑菌圈直徑分別達(dá)17.0、18.0 mm,其次是A4、B3、B8,抑菌圈直徑為13.0 mm。B3對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑達(dá)到 18.0 mm,效果最好。對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著的是B3、K7、K6,抑菌圈直徑分別為15.0、14.0、13.0 mm。對(duì)真菌指示菌灰霉病菌而言,K6抑制其生長(zhǎng)的效果最好,抑菌圈直徑為12.0 mm,其次,A3、B3、K7的抑菌效果也很好。

      3 結(jié)論

      本試驗(yàn)通過瓊脂塊法從淫羊藿中篩選得到了具有抗菌活性的A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株菌株,測(cè)定了其抑菌直徑,根據(jù)初選試驗(yàn)可以得出結(jié)論:從不同指示菌株來看,對(duì)大腸埃希菌抑菌效果最好的是K6和K7;對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果最好的是B3和K6;對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果最佳的是B3和K7;對(duì)灰霉病菌抑菌效果最好的是K6。對(duì)于內(nèi)生真菌來說,A1對(duì)大腸埃希菌抑菌效果更好;A3對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果不錯(cuò);A4對(duì)大腸埃希菌抑菌效果更佳;B3對(duì)枯草芽孢桿菌抑菌效果更好;B7和B8、K8和K9對(duì)幾種指示菌的抑菌效果相差不大;K6和K7對(duì)大腸埃希菌抑菌效果更佳。

      在復(fù)選活性測(cè)定中有4株菌株具較好的抑菌活性,B3、B8、K9對(duì)灰霉病菌菌株有較強(qiáng)的抑菌活性,B3、B7則對(duì)大腸埃希菌抑菌活性明顯,初步顯示B3菌株有廣譜的抑菌活性。對(duì)初選具抑菌活性的10種菌株的鑒定還有待進(jìn)一步的分子試驗(yàn)。

      植物內(nèi)生真菌的特殊生境決定了其具有重要的農(nóng)藥和醫(yī)藥應(yīng)用潛力,而具抗菌、抗腫瘤活性菌株豐富的次生代謝產(chǎn)物已成為藥物來源新途徑,必將在天然藥物研究中得到開發(fā)與利用。試驗(yàn)證實(shí),淫羊藿植物內(nèi)生真菌豐富,分離的部分內(nèi)生真菌菌株具明顯的抗菌活性,對(duì)其活性成分進(jìn)一步分離、分析,對(duì)新型藥物的篩選具重要意義[15]。

      參考文獻(xiàn):

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