正畸治療的年輕恒牙和成熟恒牙的牙髓組織中VEGF水平比較

劉高成， 吳佩玲， 步 江， 白新華

(1烏魯木齊市口腔醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830002； 2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830000)

牙髓是疏松的結(jié)締組織，主要功能在于形成、營養(yǎng)、防御和修復(fù)牙本質(zhì)，在修復(fù)過程中需要一系列生長因子介導(dǎo)。血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 是高度特異且具有多功能的細(xì)胞因子，不僅參與組織胚胎器官生長發(fā)育，還與炎癥、創(chuàng)傷愈合和缺血性組織的修復(fù)再生有關(guān)。Janebodin等[1]報道人牙髓組織存少量VEGF，可誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞的趨化性能，促進(jìn)牙髓細(xì)胞的增殖與分化，不同牙髓狀態(tài)對VEGF的表達(dá)有影響。Matsushita等[2]報道動物VEGF表達(dá)呈增齡性，通過干預(yù)VEGF表達(dá)可達(dá)到治愈牙髓病的目的。目前有關(guān)VEGF 在人恒牙牙髓組織的表達(dá)的研究較少，本研究分析VEGF 在人年輕恒牙及成熟恒牙牙髓中的表達(dá)。

1 對象和方法

1.1研究對象收集2010年6月-2013年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)二附院口腔科行正畸治療而需拔除的無齲健康的第一前磨牙56顆，包括年輕恒牙30顆和成熟恒牙26顆。年輕恒牙情況：牙根發(fā)育1/3～3/4，年齡6～18歲，男性20顆，女性10顆；成熟恒牙情況：年齡26～41歲，男性15顆，女性11顆。牙拔除后置于10%中性福爾馬林固定液中固定，4℃下固定48 h。排除伴全身系統(tǒng)性疾病者、哺乳期或懷孕婦女、近2個月服用抗菌素和/或免疫制劑者。

1.2指標(biāo)檢測將固定的標(biāo)本置于10%EDTA沖洗，采用脫鈣液持續(xù)脫鈣10 w，將脫鈣的標(biāo)本置于脫水機(jī)，脫水后浸蠟包埋，沿牙體中線自牙根向牙冠連續(xù)切片，每片厚4 μm[3]。采用常規(guī)免疫組化鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(Srteptvadin-bitin Complex，SABC)法進(jìn)行VEGF 抗體染色，PBS 緩沖液代替一抗為對照，DAB顯色，中性樹膠封片，4℃保存。以細(xì)胞質(zhì)與基質(zhì)染成斑點(diǎn)、顆?；蜻B續(xù)線狀的黃棕色為VEGF陽性表達(dá)。

1.3評判標(biāo)準(zhǔn)將染色強(qiáng)度分為：0級(-)：未出現(xiàn)著色顆粒；Ⅰ級(+)：呈黃色，染色弱，高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)<30%；Ⅱ級(++)：染色清晰，呈棕黃色或深黃色，高倍視野陽性細(xì)胞數(shù)>30%，利用圖像分析儀和Meta Morph/Cool snapfx/AX70軟件對陽性染色部位的透光強(qiáng)度(灰度值)定量分析。

2 結(jié)果

2.1年輕和成熟恒牙的VEGF分布與分布強(qiáng)度比較牙髓組織的VEGF 在成纖維細(xì)胞呈陽性，恒牙牙髓成纖維細(xì)胞的 VEGF 均呈陽性表達(dá)，但年輕恒牙的VEGF表達(dá)為強(qiáng)陽性，年輕恒牙牙髓中部呈強(qiáng)陽性表達(dá)，根部與冠部VEGF陽性表達(dá)明顯較弱；成熟恒牙牙髓中部呈陽性表達(dá)，根部與冠部VEGF陽性表達(dá)明顯較弱，見圖1。

注: 1、2、3為年輕恒牙的牙髓冠部、中部和根部；4、5、6為成熟恒牙的牙髓冠部、中部和根部。

2.2VEGF在年輕和成熟恒牙不同部位的表達(dá)比較年輕恒牙牙髓成纖維細(xì)胞中的VEGF呈強(qiáng)陽性表達(dá)，向冠部和根部表達(dá)逐漸減弱；成熟恒牙牙髓成纖維細(xì)胞中的VEGF呈陽性表達(dá)，向冠部和根部表達(dá)逐漸減弱。與年輕恒牙比較，成熟恒牙牙髓成纖維細(xì)胞中的VEGF表達(dá)較弱，在冠部和根部的表達(dá)較弱，見表1。

表1 VEGF在恒牙的表達(dá)水平

3 討論

牙髓(endodontium)是疏松的結(jié)締組織，牙體組織中唯一的軟組織，位于牙本質(zhì)所形成的髓腔內(nèi)，由細(xì)胞、纖維、血管、神經(jīng)和淋巴等組成，牙髓細(xì)胞又稱成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞呈星形，是牙髓的主要細(xì)胞，也是牙髓生物功能實(shí)現(xiàn)的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，牙髓的主要功能為形成、營養(yǎng)、保護(hù)和修復(fù)牙本質(zhì)[4]，其保護(hù)功能的實(shí)現(xiàn)需要一系列生長因子，如VEGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和腫瘤壞死因子(TNF-α)等，其中VEGF是由牙髓細(xì)胞分泌且血管生成作用最強(qiáng)的因子，VEGF對提高血管的通透性、促使內(nèi)皮細(xì)胞分裂、生成血管進(jìn)而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和增殖具有重要意義，其提高血管通透性的效能是組胺的5萬倍[5-7]。

本研究顯示，年輕恒牙的牙髓成纖維細(xì)胞中的VEGF呈強(qiáng)陽性表達(dá)，向冠部和根部表達(dá)逐漸減弱；成熟恒牙的牙髓成纖維細(xì)胞中的VEGF呈陽性表達(dá)，向冠部和根部表達(dá)逐漸減弱。與年輕恒牙比較，成熟恒牙的牙髓成纖維細(xì)胞中的VEGF表達(dá)較弱，在冠部和根部的表達(dá)較弱，與Matsuzaka等[8]和王青等[9]的研究結(jié)果相似。VEGF表達(dá)增強(qiáng)以及在年輕恒牙與成熟恒壓中的表達(dá)不同有以下幾方面意義：(1)正畸牙齒移動過程中，骨的改建是基于正畸牙移動，骨改建與血管改建關(guān)系密切，因此這個改建過程促使了牙髓的VEGF陽性表達(dá)，正畸牙的VEGF水平增高可促使血管的生成并提供豐富的血供與營養(yǎng)，募集破骨細(xì)胞，加快正畸牙移動，縮短正畸療程，因此VEGF水平增高對牙髓修復(fù)具有重要意義[10]；(2)牙髓中VEGF 的表達(dá)還涉及多種機(jī)制的調(diào)控，如TNF-α、IL-6和TGF-α等多種細(xì)胞因子和生長因子，缺氧、機(jī)械或理化刺激等可上調(diào)VEGF-mRNA 表達(dá)，使 VEGF 釋放到細(xì)胞外液，研究顯示正畸過程中，牙周膜受壓變窄，官腔受壓變窄，壓力區(qū)出現(xiàn)缺血缺氧，均導(dǎo)致VEGF表達(dá)增高[11-14]；(3)在牙齒發(fā)育的不同階段，恒牙牙髓的VEGF水平不同，VEGF的功能發(fā)揮是通過識別Flt-1 或 Flk-1實(shí)現(xiàn)的，與成熟恒牙比，年輕恒牙 VEGF受體Flk-1的表達(dá)是成熟恒牙的1倍以上[7]，進(jìn)一步說明年輕恒牙牙髓組織血管再生潛力高于成熟恒牙。因此增強(qiáng) VEGF的表達(dá)、促進(jìn)血管再生、誘導(dǎo)牙髓完全性修復(fù)牙本質(zhì)的形成對于成熟恒牙的牙髓修復(fù)尤其重要，除了銼激根尖部出現(xiàn)凝血，還可將外源性 VEGF 和相關(guān)受體加入到支架和牙髓細(xì)胞的復(fù)合體中，或利用基因技術(shù)，將人 VEGF 及受體基因轉(zhuǎn)入牙髓干細(xì)胞或成纖維細(xì)胞，使種子細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生VEGF 和相關(guān)受體，為修復(fù)性牙本質(zhì)形成提供足夠的血管化并調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性，從而達(dá)到治愈牙髓病的目的[3,12-15]。

關(guān)于牙髓取材的方法，采用劈牙取髓法，固定時間短，牙體無須脫鈣，切片和展片難度低，但該方法取得的牙髓組織有不同程度的破壞，根尖部破壞更明顯，牙髓根尖狹窄部位在剝離時很容易斷裂，鏡下組織撕脫表現(xiàn)明顯，而且劈牙取髓致使部分成牙本質(zhì)細(xì)胞殘留在髓腔壁。本研究采用牙體-牙髓聯(lián)合切片法，可克服直接取髓法的的缺點(diǎn)，但有固定時間長、脫鈣成本高和切片難度大等缺點(diǎn)。綜合來看，兩者均有優(yōu)缺點(diǎn)，但從切片結(jié)果解讀方面，牙體-牙髓聯(lián)合切片明顯優(yōu)于直接取髓法，該法較好地保證牙髓組織的完整性，容易區(qū)分牙髓的冠根部和成纖維細(xì)胞，更有利于研究VEFG在牙髓組織的客觀表達(dá)。

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