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    小鼠卵母細胞減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;捌鋵β涯讣毎墒熨|量的影響

    2014-07-07 06:24:48李靜心孟春花朱前明曹少先王慧利
    江蘇農(nóng)業(yè)學報 2014年2期
    關鍵詞:紡錘體乙酰化卵母細胞

    王 婧, 李靜心, 孟春花, 朱前明, 劉 勇, 曹少先, 王慧利

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所,江蘇 南京 210014;3.阜陽師范學院生命科學學院,安徽 阜陽 236041)

    組蛋白乙?;潜碛^遺傳修飾的重要組成部分,在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮了重要的生物學功能[1-2]。組蛋白乙?;c組蛋白去乙?;?HDACs)密切相關,HDACs分為 I、II、III、IV 4 類亞型[3],主要負責組蛋白去乙?;?,并在活性受到抑制后乙?;缴摺2溉閯游镏械难芯慷嗉杏趶V譜性HDACs抑制劑處理卵母細胞改變乙?;癄顟B(tài)[4-7],對減數(shù)分裂過程中具體調(diào)控組蛋白乙?;腍DACs亞型知之不多。

    哺乳動物中,生發(fā)泡(Germinal vesicle,GV)期卵母細胞組蛋白均高度乙?;珜τ跍p數(shù)分裂過程中是否存在組蛋白乙?;?去乙?;膭討B(tài)變化,不同研究間存在矛盾[4-11]。此外,利用HDACs抑制劑處理卵母細胞來研究組蛋白乙酰化對發(fā)育的影響,不同學者得到的結論并不相同[12-17],分析發(fā)現(xiàn),上述研究所用HDACs抑制劑均為廣譜性藥物,是否因為這種廣譜性抑制導致了對發(fā)育影響的不確定性?因此,有必要進一步研究HDACs特異性抑制后組蛋白乙?;瘜β涯讣毎l(fā)育的影響。

    本試驗以組蛋白H4K12乙酰化為標記,利用免疫熒光技術,首先對小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中組蛋白乙?;谋磉_模式進行研究,然后分別利用廣譜及特異性HDACs抑制劑處理減數(shù)分裂中的卵母細胞,以確定調(diào)控組蛋白乙酰化的HDACs亞型。在此基礎上,進一步明確減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙酰化的動態(tài)變化規(guī)律,最后就組蛋白乙?;瘜β涯讣毎墒熨|量的影響進行探討,以期為闡明哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂過程中組蛋白乙?;恼{(diào)控機制提供理論基礎。

    1 材料與方法

    試驗所需試劑除特殊說明外均購自Sigma試劑公司。

    1.1 卵母細胞獲取及培養(yǎng)

    試驗所用6~8周齡ICR小鼠均購自南京市青龍山動物繁殖場,經(jīng)促性腺激素超排后(10 IU/ml PMSG 48 h),脫頸椎法殺鼠并摘除卵巢,于實體鏡下刺破卵泡,收集生發(fā)泡(GV)期卵母細胞,M2洗滌后轉移到成熟培養(yǎng)液中依試驗設計進行培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)液為TCM-199(Gibco)添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.1%牛血清白蛋白(BSA)、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、10 ng/ml表皮生長因子(EGF)、0.5 IU/ml促卵泡激素(FSH)、0.5 IU/ml黃體生成素(LH)。培養(yǎng)條件為37℃,5%CO2,100%濕度。

    1.2 卵母細胞免疫熒光檢測

    卵母細胞依試驗設計處理完畢后,自培養(yǎng)液中取出并脫去卵丘,4%多聚甲醛室溫固定1 h,0.2%Triton X-100(D-PBS配制)處理10~15 min,封閉液(D-PBS含0.2%BSA+0.01%Tween-20)處理1 h,一抗(封閉液稀釋)4℃孵育過夜,二抗(封閉液稀釋)37℃處理2 h,10μg/ml Hoechst 33342室溫染色5 min以標記卵母細胞染色體DNA,染色完畢后將卵母細胞壓片經(jīng)熒光顯微鏡觀察結果并采集圖片。其中組蛋白H4K12乙?;贵w購自Upstate公司,一抗為Rabbit polyclonal anti-acetyl-H4-Lys12,二抗為 FITC-conjugated goat-anti-rabbit IgG,紡錘體微管抗體為FITC-conjugated anti-α-tubulin monoclonal antibodies。

    1.3 試驗設計

    1.3.1 減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化狀態(tài) 超排后獲取的GV期卵母細胞放入成熟培養(yǎng)液中,于培養(yǎng)0 h、6 h、16 h將卵母細胞進行免疫熒光染色,分別檢測GV、MI、MII期卵母細胞的H4K12乙?;癄顟B(tài)。1.3.2 減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙?;腍DACs亞型 超排后獲取的GV期卵母細胞分別放入添加廣譜及亞型特異性HDACs抑制劑的成熟培養(yǎng)液中,于培養(yǎng)16 h將卵母細胞進行免疫熒光染色,通過檢測抑制劑處理后MII期卵母細胞H4K12乙?;淖兓?,確定減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙?;腍DACs亞型。

    1.3.3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙?;g的動態(tài)變化規(guī)律 在確定調(diào)控減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化的HDACs亞型的基礎上,通過2種方法檢測減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙?;淖兓?guī)律:①先正常培養(yǎng)卵母細胞,然后利用亞型特異性HDACs抑制劑處理;②先利用亞型特異性HDACs抑制劑處理卵母細胞,然后撤掉抑制劑進行正常培養(yǎng)。隨后通過免疫熒光染色檢測相應處理后卵母細胞H4K12乙?;淖兓?,確定減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙?;膭討B(tài)變化規(guī)律。

    1.3.4 組蛋白乙酰化對卵母細胞成熟質量的影響

    超排后獲取的GV期卵母細胞放入對照組和試驗組培養(yǎng)液中,對照組不添加HDACs抑制劑,試驗組分別添加亞型特異性和廣譜性HDACs抑制劑以增加組蛋白乙?;?。經(jīng)培養(yǎng)16 h后,將卵母細胞取出,通過觀察第一極體排出情況,檢測成熟率的變化;通過紡錘體微管免疫熒光染色,檢測紡錘體形態(tài)的變化;通過Hoechst 33342染色,檢測染色體排列方式的變化。根據(jù)上述3個指標的變化,探討組蛋白乙?;瘜β涯讣毎墒熨|量的影響。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

    每組試驗至少重復3次,每次用卵不少于30枚。試驗數(shù)據(jù)利用SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS 11.5)的ANOVA模塊分析。數(shù)據(jù)先經(jīng)LSD轉換(百分數(shù)t檢驗)后,進行單因素方差分析。

    2 結果

    2.1 減數(shù)分裂期間組蛋白乙酰化狀態(tài)

    結果(圖1)顯示,以組蛋白H4K12乙?;癁闃擞?,不同減數(shù)分裂階段的卵母細胞具有不同的乙酰化狀態(tài)。GV期卵母細胞呈現(xiàn)高度的乙?;癄顟B(tài),而隨減數(shù)分裂啟動,GV期染色質凝集為致密的染色體,同時發(fā)生去乙?;?,在MI期和MII期卵母細胞中均表現(xiàn)為去乙?;癄顟B(tài)。

    圖1 GV、MI、MII期卵母細胞中組蛋白H4K12的乙?;癄顟B(tài)Fig.1 Acetylation of histone H4K12 in germinal vesicle,metaphase I,melaphase II oocytes

    2.2 減數(shù)分裂期間調(diào)控組蛋白乙酰化的HDACs亞型

    以組蛋白H4K12乙?;癁闃擞洠?jīng)不同類型HDACs抑制劑處理后,M II期卵母細胞呈現(xiàn)不同的乙酰化狀態(tài)(圖2)。對照組卵母細胞未經(jīng)抑制劑處理,呈現(xiàn)去乙?;癄顟B(tài);而利用廣譜性HDACs抑制劑TSA(可同時抑制I和II型HDACs,100 nmol/L)處理后,卵母細胞發(fā)生乙?;?,表明I和(或)II型HDACs負責卵母細胞乙?;?進一步利用I型HDACs特異性抑制劑VPA(1 mmol/L)處理后,結果與對照組相同,卵母細胞去乙?;?,表明I型HDACs不參與組蛋白乙?;?而經(jīng)II型HDACs特異性抑制劑MC1568(20 μmol/L)處理后,與TSA處理相同,卵母細胞發(fā)生乙?;?,這表明II型HDACs負責減數(shù)分裂過程中組蛋白乙酰化的調(diào)控。

    2.3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙?;膭討B(tài)變化規(guī)律

    通過2種方法檢測卵母細胞減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙?;膭討B(tài)變化規(guī)律。方法一:獲取的新鮮GV期卵母細胞先正常培養(yǎng)12 h,然后經(jīng)MC1568處理4 h。結果(圖3)顯示,GV期卵母細胞中組蛋白高度乙?;?,培養(yǎng)12 h后,卵母細胞發(fā)生去乙?;谂囵B(yǎng)12 h后再利用MC1568處理4 h,卵母細胞則重新乙酰化。方法二:獲取的新鮮GV期卵母細胞先經(jīng)MC1568處理12 h,然后撤掉MC1568正常培養(yǎng)4 h。結果(圖3)顯示,GV期卵母細胞中組蛋白高度乙?;?,MC1568處理12 h后卵母細胞仍然保持乙?;?,而在撤掉MC1568后正常培養(yǎng)4 h,卵母細胞則發(fā)生去乙?;I鲜?種方法得到的結果表明,在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中,存在組蛋白乙?;?去乙?;膭討B(tài)變化。

    2.4 組蛋白乙?;瘜β涯讣毎墒熨|量的影響

    采用3個指標(成熟率、紡錘體形態(tài)和染色體排列方式)反映組蛋白乙?;瘜β涯讣毎墒熨|量的影響。結果顯示:培養(yǎng)液中添加20μmol/L MC1568后,卵母細胞的成熟未受影響,成熟率均超過90%(圖4);卵母細胞經(jīng)MC1568處理后,紡錘體形態(tài)并未發(fā)生明顯改變,均表現(xiàn)為典型的紡錘體形態(tài)(圖5);卵母細胞經(jīng)MC1568處理后,染色體的排列方式未受影響,呈典型的中期排列形態(tài)(圖6)。說明II型HDACs特異性抑制劑MC1568處理并未對卵母細胞的成熟質量產(chǎn)生影響。

    圖2 不同種類HDACs抑制劑處理后M II期卵母細胞中組蛋白H4K12的乙酰化狀態(tài)Fig.2 Acetylation of histone H4K12 in melaphase II oocytes treated with different HDACs inhibitors

    圖3 減數(shù)分裂期間組蛋白乙?;?去乙?;膭討B(tài)變化Fig.3 Dynamic changes in histone acetylation/deacetylation during meiosis

    圖4 組蛋白乙酰化對卵母細胞成熟率的影響Fig.4 Effects of histone acetylation on rates of oocyte maturation

    進一步利用廣譜性HDACs抑制劑TSA替代MC1568處理卵母細胞,發(fā)現(xiàn)100 nmol/L TSA處理后,卵母細胞的成熟能力和紡錘體結構均未受顯著影響,但與對照組及MC1568處理組相比,約有30%的卵母細胞染色體排列方式發(fā)生了改變,結構比較松散,分布面積變大(圖6)。說明廣譜性HDACs抑制劑處理影響了卵母細胞的成熟質量。

    圖5 組蛋白乙?;瘜β涯讣毎忓N體形態(tài)的影響Fig.5 Effects of histone acetylation on spindle morphology of oocytes

    圖6 組蛋白乙?;瘜β涯讣毎旧w排列的影響Fig.6 Effects of histone acetylation on chromosome alignment of oocytes

    3 討論

    組蛋白乙?;欣诤诵◇wDNA與組蛋白八聚體的解離,使染色體結構松弛,從而促進基因的轉錄,而組蛋白去乙?;瘎t可導致組蛋白與DNA緊密結合,染色體致密卷曲,抑制基因轉錄。本研究中,減數(shù)分裂啟動后,小鼠卵母細胞由GV期的乙?;D變?yōu)镸 I和M II期的去乙?;?,并且這種轉變伴隨著相對松散的染色質凝集為致密的染色體,以及基因轉錄活動的中止[18],這正體現(xiàn)了組蛋白乙酰化/去乙?;瘜θ旧|(體)結構及基因表達的調(diào)控。

    研究者多利用廣譜HDACs抑制劑處理哺乳動物卵母細胞,通過抑制整個HDACs酶家族的活性,使組蛋白乙?;缴撸?-7,11],但對于酶家族內(nèi)具體發(fā)揮作用的HDACs亞型及分子知之不多,目前僅見Endo等初步鑒定了豬卵母細胞中調(diào)控組蛋白乙?;腍DACs類型,發(fā)現(xiàn)I型HDACs并非組蛋白去乙?;匦瑁?9]。本研究也發(fā)現(xiàn)小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中I型HDACs不參與組蛋白的去乙?;?,并且進一步證明II型HDACs發(fā)揮了去乙酰化功能。

    組蛋白乙?;?去乙酰化,分別由組蛋白乙?;D移酶(HATs)和HDACs所催化。HATs和 HDACs存在動態(tài)的平衡,當HDACs受到抑制,HATs活化,組蛋白乙?;?當HATs受到抑制,HDACs活化,組蛋白去乙?;1狙芯客ㄟ^2種方法從不同側面確認了小鼠卵母細胞減數(shù)分裂過程中存在組蛋白乙?;?去乙酰化間的動態(tài)變化,表明卵母細胞中的HATs和HDACs均具有活性,協(xié)同調(diào)控組蛋白乙?;?去乙酰化的變化。但Kim等發(fā)現(xiàn),小鼠卵母細胞正常培養(yǎng)14 h后用TSA處理3 h,組蛋白未重新乙?;砻鱄ATs沒有活性[7]。我們推測,原因可能在于TSA處理時間較短,HDACs受到抑制后HATs活化需要時間。在進一步重復Kim等的試驗后,我們發(fā)現(xiàn)TSA處理3 h后,組蛋白乙?;拇_不明顯,但延長至4 h,組蛋白重新乙酰化,與本研究結果一致。

    利用II型HDACs抑制劑MC1568處理增加乙?;胶?,小鼠卵母細胞的成熟率、紡錘體結構及染色體排列方式均未受影響,但經(jīng)廣譜抑制劑TSA處理后,染色體的結構變得松散,并且分布面積變大。這在一定程度上驗證了前言中的推測,即廣譜HDACs抑制劑導致整個HDACs酶家族活性受到抑制,包括與組蛋白乙?;療o關的HDACs酶活性也受到抑制,這可能導致對卵母細胞有益和有害的HDACs分子間存在不同程度的相互抵消,因此產(chǎn)生了對成熟和發(fā)育影響的不確定性,導致不同研究者間結論的差異。在進一步明確卵母細胞中發(fā)揮作用的HDACs亞型后,就本試驗的成熟質量指標而言,特異性升高組蛋白乙?;瘜Πl(fā)育并無損害。

    綜上所述,本研究確定了小鼠卵母細胞中調(diào)控組蛋白乙?;腍DACs亞型,揭示了減數(shù)分裂期間存在組蛋白乙?;?去乙酰化的動態(tài)變化,并明確了組蛋白乙酰化對卵母細胞成熟質量的影響,這為提高哺乳動物胚胎體外生產(chǎn)效率及闡明組蛋白乙?;{(diào)控的分子機制提供了參考。

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