一株雞源致病性大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學(xué)特性

王禮偉， 梁 晏， 屈勇剛， 楊亞東， 李 飛， 楊一鳴， 施研進(jìn)

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)八師石河子總場(chǎng)北泉鎮(zhèn)獸醫(yī)站，新疆 石河子832011

目前，在雞業(yè)發(fā)展過程中，大腸桿菌病是一種較為常見高發(fā)病，常造成雞局部或全身性感染［1-2］。大腸桿菌病是一種條件致病菌，差的衛(wèi)生條件、不良的衛(wèi)生管理，很容易造成大腸桿菌病的發(fā)生。隨著養(yǎng)雞業(yè)規(guī)?；⒓s化的不斷發(fā)展，大腸桿菌病越發(fā)嚴(yán)重，病原對(duì)抗生素和抗菌藥的耐藥性越來越強(qiáng)。為了防治雞大腸桿菌病，飼養(yǎng)主大多采用飼喂抗生素或抗菌藥物的方法，但普遍存在耐藥性和用藥成本升高等問題。同時(shí)，由于長期使用抗生素或抗菌藥，使產(chǎn)品存在藥物殘留，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降，很難滿足人們對(duì)綠色健康養(yǎng)殖的要求。

噬菌體是以細(xì)菌為寄主的一類非細(xì)胞微生物。自1917年人們發(fā)現(xiàn)噬菌體以來，利用噬菌體預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病引起了人們的關(guān)注［3］。早在20世紀(jì)初噬菌體治療就已經(jīng)取得過可喜的成果，國外第一次公開報(bào)道的噬菌體治療是在1921年，利用噬菌體制劑治療葡萄球菌皮膚感染［4］。現(xiàn)今，噬菌體的運(yùn)用越來越廣泛。利用噬菌體治療具有一些先天性的優(yōu)勢(shì):自身的繁殖能力強(qiáng)、裂解細(xì)菌的特異性較強(qiáng)、無耐藥性、無殘留等。本研究擬從養(yǎng)殖場(chǎng)污水及糞便中分離雞大腸桿菌噬菌體，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株和污水

28株雞源致病性大腸桿菌(Eco1～Eco28)由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，凍干保存于－20℃。污水采自石河子周邊地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)附近，共10份。

1.2 主要試劑

LB培養(yǎng)基按文獻(xiàn)［5］配制;普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 宿主菌的準(zhǔn)備

將28株雞源致病性大腸桿菌分別接種到裝有3 ml液體LB液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，備用。

1.4 噬菌體的富集與分離

將采集的污水用8層紗布過濾，再用2層濾紙過濾，取過濾后的污水2.5 L，加入固體 CaCl2使終濃度達(dá)到1 mmol/L，在10 000 r/min下離心10 min。過濾除菌，取液體1 L，加入30 ml液體LB培養(yǎng)基和28株新鮮培養(yǎng)的雞源致病性大腸桿菌懸液各1 ml，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，在10 000 r/min下離心5 min，上清液用0.22μm的濾膜過濾除菌。取28支試管，每管分別加入新鮮培養(yǎng)的28株雞源致病性大腸桿菌懸液0.3 ml，再加入處理后的液體0.3 ml，振蕩使其充分混勻，室溫下靜置10～15 min，使噬菌體和宿主菌充分吸附。再加5 ml已溶化的50℃左右0.7%半固體LB培養(yǎng)基，再次振蕩混勻，然后均勻地鋪在1.8%的固體LB瓊脂上，待其凝固后，37℃倒置培養(yǎng)8～12 h，觀察噬菌斑的生長情況［6］。

1.5 噬菌體的純化

當(dāng)有噬菌斑出現(xiàn)時(shí)，先取相應(yīng)的宿主菌接種到5 ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。然后用10 μl槍頭挑取單個(gè)噬菌斑接種到相應(yīng)的宿主菌培養(yǎng)物中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng) 8 h，擴(kuò)增噬菌體。然后在10 000 r/min下離心5 min，過濾除菌，無菌取上清液。單個(gè)噬菌斑經(jīng)此方法反復(fù)純化3～5次，即可得到較純的噬菌體。

1.6 噬菌體的保存

將分離純化后得到的噬菌體1 ml移入1.5 ml凍存管，每株噬菌體6管，置于－20℃冰箱中保存。

1.7 噬菌體生物學(xué)特性測(cè)定

1.7.1 噬菌體效價(jià)(滴度)測(cè)定 用LB液體培養(yǎng)基作為稀釋液，把純化后的噬菌體做連續(xù)10倍稀釋，分別取100μl加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min，使噬菌體充分吸附宿主菌。再加入5 ml已溶化的50℃左右的0.7%LB半固體培養(yǎng)基，再次振蕩混勻，采用雙層瓊脂平板法，觀察噬菌斑的生長情況［7］。上述每個(gè)稀釋度分別做3個(gè)平行重復(fù)。計(jì)數(shù)時(shí)，選取噬菌斑數(shù)為30～300的稀釋度平板，然后取適當(dāng)稀釋度3個(gè)平行重復(fù)的平均數(shù)，以計(jì)算噬菌體的滴度。噬菌體的效價(jià)(PFU/ml)=稀釋倍數(shù)×平均噬菌斑數(shù)×100。

1.7.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［8］，采用單斑法進(jìn)行測(cè)定:即取28株雞源致病性大腸桿菌的菌懸液分別均勻地涂在固體LB瓊脂平板上，然后分別取2μl純化后的噬菌體懸液，滴在平板不同的位置上，每板可滴4～6滴，懸液之間不能接觸，37℃培養(yǎng)8～12 h，觀察噬菌斑的生長情況。

1.7.3 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)是指感染發(fā)生之前，噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復(fù)數(shù)為獲得子代噬菌體最高產(chǎn)量時(shí)的MOI。據(jù)文獻(xiàn)［9］，取分離株噬菌體對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)期菌懸液，按感染復(fù)數(shù)分別為 0.001、0.010、0.100、1.000加入噬菌體。37℃搖床振蕩培養(yǎng)8 h，采用雙層瓊脂平板法測(cè)定最佳感染復(fù)數(shù)。

1.7.4 噬菌體的pH穩(wěn)定性測(cè)定 用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)配制 pH 為4、5、6、7、8、9的 LB 液體培養(yǎng)基。取不同 pH 值的液體LB培養(yǎng)基1 ml分別加入試管，高壓滅菌。將100μl噬菌體加入試管，在37℃條件下反應(yīng)2 h。利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，取100μl噬菌體處理液，加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法，測(cè)定不同pH值條件下噬菌體的效價(jià)。

1.7.5 噬菌體的溫度穩(wěn)定性測(cè)定 調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃。將分離株噬菌體放在水浴鍋靜置1 h。利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，取100μl噬菌體處理液，加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法，測(cè)定不同溫度條件下噬菌體的效價(jià)。

1.7.6 噬菌體的紫外線穩(wěn)定性測(cè)定 將1 ml噬菌體稀釋液(1.98×102PFU/ml)加入平板中，直接暴露在超凈工作臺(tái)中，紫外線照射燈功率為20 W，距離為40 cm。在0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min 時(shí)，取 100 μl噬菌體處理液加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌，振蕩使其充分混勻，室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法，測(cè)定不同照射時(shí)間條件下噬菌體的效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌噬菌體的分離及噬菌斑的觀察

采用雙層瓊脂平板法，肉眼可見大小不一、邊緣整齊、無暈環(huán)、透明清晰的噬菌斑，在顯微鏡下測(cè)量其直徑為0.597 mm。最終分離純化出1株大腸桿菌噬菌體，將其命名為EcP10。

2.2 噬菌體EcP10效價(jià)(滴度)

通過雙層瓊脂平板法測(cè)定可知，噬菌體EcP10的效價(jià)為1.95 ×108PFU/ml。

2.3 噬菌體EcP10裂解譜

通過噬菌譜的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)噬菌體EcP10可裂解28株雞源致病性大腸桿菌(Eco1～Eco28)中的12株(Eco2、Eco4、Eco5、Eco6、Eco10、Eco13、Eco15、Eco16、Eco20、Eco23、Eco25、Eco26)，其裂解率為42.86%。

2.4 噬菌體EcP10的最佳感染復(fù)數(shù)

經(jīng)過8 h的培養(yǎng)，通過效價(jià)的測(cè)定，當(dāng)MOI=1時(shí)，噬菌體EcP10產(chǎn)生子代的效價(jià)為 5.8×108PFU/ml，為在4種不同條件下最高的，說明EcP10的最佳感染復(fù)數(shù)為1。

2.5 噬菌體EcP10的p H值穩(wěn)定性

噬菌體EcP10經(jīng)過6種不同的pH條件(pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9)處理2 h 后，在 pH 值為6 的時(shí)候，噬菌體的效價(jià)最高，為 6.25×106PFU/ml。當(dāng)pH為4時(shí)，效價(jià)下降到3.3×105PFU/ml;當(dāng)pH為9時(shí)，效價(jià)下降到1.15×105PFU/ml。這種趨勢(shì)說明過酸、過堿都會(huì)造成噬菌體的裂解能力下降，明顯影響噬菌體EcP10的活性。

2.6 噬菌體EcP10的溫度穩(wěn)定性

噬菌體EcP10經(jīng)過4種不同溫度(30℃、40℃、50℃、60℃)條件處理1 h后，溫度為30℃時(shí)效價(jià)最高，達(dá)到6.75×105PFU/ml，同時(shí)，30 ～50 ℃ 時(shí)效價(jià)均維持在 105PFU/ml以上;60℃時(shí)，效價(jià)明顯下降。這種趨勢(shì)說明高溫也嚴(yán)重影響噬菌體的活性。

2.7 噬菌體EcP10的紫外線穩(wěn)定性

隨著紫外線照射時(shí)間的持續(xù)，噬菌斑數(shù)目測(cè)定結(jié)果表明，噬菌體EcP10的活性逐漸降低。紫外線持續(xù)照射12 min時(shí)僅產(chǎn)生2個(gè)噬菌斑，紫外線的照射直接導(dǎo)致噬菌體快速失活。

2.8 噬菌體EcP10保存時(shí)間

分離株噬菌體EcP10在－20℃冰箱中保存1個(gè)月，噬菌體的效價(jià)為1.40×108PFU/ml，沒有發(fā)生明顯的變化。

3 討論

噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，可分為裂解性噬菌體和溫和噬菌體。噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌的裂解和感染是特異性的，是由受體決定的，很少產(chǎn)生耐藥性的問題，也不會(huì)造成機(jī)體的菌群失調(diào)，每種細(xì)菌都有自身敏感的噬菌體。利用這一特性，用噬菌體殺滅細(xì)菌，稱為噬菌體療法［9］。作為一種微生態(tài)制劑，噬菌體治療具有取材廣泛、繁殖能力強(qiáng)、裂解細(xì)菌相對(duì)特異性、無耐藥性、無殘留等優(yōu)點(diǎn)。因此，噬菌體相關(guān)研究越來越受到人們的重視［10］。近年來，噬菌體微生態(tài)制劑，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境控制等相關(guān)領(lǐng)域［11］。

本試驗(yàn)利用雞源致病性大腸桿菌作為宿主菌，從采自石河子周邊地區(qū)雞場(chǎng)附近的污水中分離純化出1株雞源致病性大腸桿菌噬菌體EcP10，同時(shí)對(duì)分離株噬菌體EcP10的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過效價(jià)、噬菌譜、最佳感染復(fù)數(shù)、pH值穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性的測(cè)定，以及在－20℃條件下保存1個(gè)月的效價(jià)變化等多項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，證實(shí)該分離株噬菌體EcP10具有較高的效價(jià)、較廣的噬菌譜和較好的穩(wěn)定性。本研究為后期研發(fā)噬菌體微生態(tài)制劑，開展噬菌體治療工作奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)［M］.5版，中國農(nóng)業(yè)出版社，2006:111-112.

［2］ 程 漢，胡新崗，曹軍平.雞大腸桿菌病病原的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(3):172-174.

［3］ ALISKY J，ICZKOWSKI K，RAPOPORT A.Bacteriophages show promise as antimicrobial agents［J］.J Infect，1998，36:5-15.

［4］ PAYNE R J，PHIL D，JANSEN V A.Phage therapy:the peculiar kinetics of self-replicating pharmaceuticals［J］.Clinical Pharmacology and Therapeutics，2000，68(3):225-230.

［5］ SAMBROOK J，RUSSELL D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.黃培堂，譯.3版.科學(xué)出版社，2002:27-30.

［6］ JAMALLUDEEN N，JOHNSON R P，F(xiàn)RIENDSHIPR，et al.Isolation and characterrization of nine bacteriophages that lyse O149 enterotoxigenic Escherization coli［J］.Vet Microbiol，2007，124:47-57.

［7］ 段書月，劉書梅，王國棟.肉雞大腸桿菌的分離鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2008，27(1):11-13.

［8］ 中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心.全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果簡介［J］.中國結(jié)核病預(yù)防控制，2011(3):14-16.

［9］ 孫榮華，李菁華，史紅艷，等.大腸埃希菌噬菌體的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2009，4(2):88-90.

［10］ LEDERBERGJ.Genetic recombination in Escherichia coli:disputation at cold spring harbor，1946-1996［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:3167-3168.

［11］ MCGRATH S，SINDEREND V.Bacteriophage:genetics and molecular biology［M］.Norfolk England:Caister Academic Press，2007:1221.