ARRB1融合蛋白表達(dá)載體ARRB1-EGFP的構(gòu)建及其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

文普帥，高 靜遼寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州 000；遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 超聲科，遼寧錦州000

ARRB1融合蛋白表達(dá)載體ARRB1-EGFP的構(gòu)建及其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)

文普帥1，高 靜21遼寧醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，遼寧錦州 121000；2遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 超聲科，遼寧錦州121000

目的 構(gòu)建重組表達(dá)載體ARRB1-EGFP，在細(xì)胞中表達(dá)與鑒定，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。方法 RT-PCR獲得編碼人ARRB1的全基因序列，克隆到真核表達(dá)載體pEGFPN1，構(gòu)建重組表達(dá)載體ARRB1-EGFP，并轉(zhuǎn)化于E.coli DH5α中篩選陽(yáng)性重組子，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳鑒定和DNA序列測(cè)定正確后，轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot檢測(cè)蛋白的特異性，應(yīng)用免疫熒光方法比較融合蛋白與內(nèi)源性ARRB1在SNB19細(xì)胞的定位。結(jié)果 成功構(gòu)建了ARRB1融合蛋白的真核表達(dá)載體，并經(jīng)Western blot鑒定正確。免疫熒光提示融合蛋白與內(nèi)源性ARRB1定位相似。結(jié)論 ARRB1-EGFP融合蛋白可以安全、高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入HEK293以及SNB19細(xì)胞中。

ARRB1蛋白；載體構(gòu)建；表達(dá)；融合蛋白

ARRB1(β-arrestin1)是Arrestin家族成員之一，在全身各組織廣泛表達(dá)，在腦和脾組織中表達(dá)最多，分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[1-2]。最初發(fā)現(xiàn)，ARRB家族能夠負(fù)向調(diào)節(jié)GPCR受體信號(hào)通路[3]。后續(xù)研究表明，該家族作為內(nèi)吞適配器、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子以及支架蛋白可以調(diào)控細(xì)胞多種生理功能，例如調(diào)節(jié)Wnt、TGFB、Notch與IGF-1受體等信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[4-13]。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)ARRB1能夠調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、存活、遷移以及腫瘤血管發(fā)生等行為[14-22]。近年來(lái)的研究表明ARRB1在腫瘤組織中異常表達(dá)。Li等[23]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和黑色素瘤細(xì)胞中ARRB1的mRNA水平明顯增高；而Michal等[21]的結(jié)果恰恰相反，發(fā)現(xiàn)ARRB1水平降低，并與患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。本文構(gòu)建了含有ARRB1和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，成功在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并觀察到與內(nèi)源性ARRB1相似的定位，為深入探討ARRB1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料和試劑 載體pEGFPN1購(gòu)自Addgene公司；人胚腎細(xì)胞HEK293和神經(jīng)膠質(zhì)瘤SNB19細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所提供；PCR回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；XhoⅠ、HindⅢ、EcoRI、T4 DNA連接酶以及Phusion超保真DNA聚合酶購(gòu)自NEB公司；核酸相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物(DM2000和1K) (康為世紀(jì))，蛋白預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)參照物均為美國(guó)Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購(gòu)自全式金公司；寡核苷酸引物合成及DNA序列測(cè)定由華大基因公司完成；ARRB1多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗購(gòu)自Invitrogen公司。

2 ARRB1基因引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增 用RT-PCR從人胚腎細(xì)胞的poly(A+)RNA中擴(kuò)增ARRB1的cDNA，兩端分別引入XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。上游引物：5'-TATCTCGAGGCCACCATGGGCGACAAAGG GACC-3'；下游引物：5'-TATAAGCTTTCTGTTGTT GAGCTGTGG。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min，循環(huán)35次后，72℃保溫10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

3 ARRB1-EGFP載體的構(gòu)建 ARRB1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及載體pEGFPN1經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后應(yīng)用瓊脂糖凝膠DNA回試劑盒純化回收，在T4連接酶的作用下16℃連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，在卡那霉素陽(yáng)性細(xì)菌平板篩選出單個(gè)陽(yáng)性克隆，提取細(xì)菌質(zhì)粒行EcoRI單酶切鑒定，并送華大基因公司測(cè)序。待測(cè)序正確后，再大量提取該質(zhì)粒，命名為ARRB1-EGFP。

4 ARRB1-EGFP融合蛋白的表達(dá)及Western blot檢測(cè) 利用LipofectamineTM2000將ARRB1-EGFP及對(duì)照質(zhì)粒pEGFPN1分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，6 ～8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，以抗GFP多克隆抗體為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)。

5 ARRB1-EGFP融合蛋白及內(nèi)源ARRB1在細(xì)胞內(nèi)定位的比較 將ARRB1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SNB19細(xì)胞中，36 h后棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗3次，DAPI室溫5 min，PBS洗3次，封片，熒光顯微鏡觀察。免疫熒光檢測(cè)內(nèi)源ARRB1時(shí)，常規(guī)固定、封閉后，加入抗ARRB1多克隆抗體(濃度為1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，加入山羊抗兔IgGFITC(濃度為1∶500)，37℃孵育1 h，PBS洗3次，DAPI室溫5 min，PBS洗3次，封片，熒光顯微鏡觀察。

結(jié) 果

1 ARRB1基因的擴(kuò)增 經(jīng)RT-PCR反應(yīng)后，1%瓊脂糖凝膠電泳見(jiàn)約1.3 kb處有亮帶，與預(yù)計(jì)ARRB1基因片段大小相符。見(jiàn)圖1。

2 ARRB1-EGFP的酶切鑒定及測(cè)序報(bào)告 挑取單個(gè)白色菌斑，擴(kuò)大培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，由于載體pEGFPN1和距ARRB1基因其實(shí)位點(diǎn)483 bp處存在EcoRI位點(diǎn)，所以，質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切鑒定，酶切后產(chǎn)生5 126 bp和785 bp的兩個(gè)條帶，分別為載體和ARRB1基因片段(圖2)，說(shuō)明酶切片段的大小和插入方向均與預(yù)計(jì)相同，將鑒定正確的菌液送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，利用NCBI的BLAST服務(wù)器將測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中已登記的ARRB1序列進(jìn)行比對(duì)分析，同源性達(dá)到100%，以上結(jié)果均表明表達(dá)載體ARRB1-EGFP構(gòu)建成功。

圖 1 ARRB1基因的PCR擴(kuò)增M： DM2000標(biāo)準(zhǔn)參照物；1： ARRB1基因Fig. 1 Application of ARRB1gene by RT-PCRM: DM2000 DNA ladder; 1: ARRB1 Gene

圖 2 ARRB1-EGFP融合蛋白載體的酶切鑒定M1： DM2000標(biāo)準(zhǔn)參照物； 1： ARRB1-EGFP融合蛋白載體； M2： 1K標(biāo)準(zhǔn)參照物Fig. 2 Restriction enzyme digestion of ARRB1-EGFP vector M2: DM2000 DNA ladder； 1： ARRB1-EGFP fusion protein vector；M2:1K DNA

3 ARRB1-EGFP融合蛋白在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) 將ARRB1-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，24 h后提取蛋白，經(jīng)蛋白免疫印跡檢測(cè)在相對(duì)分子質(zhì)量80 kU附近檢測(cè)到一特異性條帶，與預(yù)期的融合蛋白大小一致(圖3)。上述結(jié)果顯示成功在HEK293細(xì)胞中特異表達(dá)ARRB1-EGFP融合蛋白。

4 ARRB1-EGFP融合蛋白與內(nèi)源性ARRB1細(xì)胞內(nèi)定位比較 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，可檢測(cè)到ARRB1胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)有強(qiáng)烈的綠色熒光表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞核內(nèi)也有熒光表達(dá)，與內(nèi)源性ARRB1的亞細(xì)胞定位相似，提示ARRB1-GFP能夠在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)良好。見(jiàn)圖4。

圖 3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)ARRB1-EGFP融合蛋白的表達(dá)Fig. 3 Expression of ARRB1-EGFP d e t e c t e d b y Western blot

圖 4 免疫熒光檢測(cè)ARRB1-EGFP在神經(jīng)膠質(zhì)瘤SNB19細(xì)胞中的表達(dá)與定位A： FITC標(biāo)記的內(nèi)源性ARRB1； B： DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核； C：綠色與藍(lán)色熒光重疊雙染； D： 融合蛋白ARRB1-EGFP熒光； E： DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核； F： 綠色與藍(lán)色熒光重疊雙染；標(biāo)尺： 25 μmFig. 4 Expression and localization of ARRB1-EGFP in SNB19 cells detected by immunofluorescenceA: FITC- labled endogenous ARRB1; B: DAPI- labled nucleus; C: merge of A and B; D: fluorescence of fusion protein ARRB1-EGFP; E: DAPI- labled nucleus; F： merge of D and E; scale bar: 25 μm

討 論

Benovic等[24]從牛腦中純化能夠引起G蛋白偶聯(lián)受體(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)脫敏的β-腎上腺素受體激酶(beta adrenergic receptor kinase，βARK)時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-ARK的純度越高引起β2-腎上腺素能受體脫敏的作用越弱，猜測(cè)存在一種對(duì)調(diào)節(jié)GPCRs脫敏起至關(guān)重要的蛋白質(zhì)。隨后即發(fā)現(xiàn)了ARRB1以及家族其他成員，從而開(kāi)始了對(duì)ARRB家族的功能學(xué)研究。近幾年研究發(fā)現(xiàn)ARRB1在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)，并與患者預(yù)后相關(guān)[21,23]。另外，有研究表明ARRB1參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為：Buchanan等[25]發(fā)現(xiàn)ARRB1能夠與前列腺素E受體和c-Src形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活表皮生長(zhǎng)因子受體和下游分子Akt，從而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移。Feigin等[20]發(fā)現(xiàn)表達(dá)ARRB1顯性負(fù)性突變體能夠降低PAR-2引起的細(xì)胞遷移，沉默ARRB1能夠降低MDA MB-231細(xì)胞基礎(chǔ)遷移能力。此外，ARRB1轉(zhuǎn)基因小鼠血漿中VEGF濃度以及腫瘤組織中新生血管形成高于對(duì)照組[22]。這些研究結(jié)果提示ARRB1參與調(diào)節(jié)腫瘤遷移、血管形成等過(guò)程。然而，ARRB1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究鮮有報(bào)道。

我們未發(fā)表的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ARRB1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低，并與患者生存時(shí)間存在相關(guān)性，為了研究ARRB1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能，根據(jù)ARRB1 cDNA序列，本研究設(shè)計(jì)正反向特異性引物，并在引物中加入XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，以HEK293細(xì)胞的cDNA為模板，擴(kuò)增出ARRB1 cDNA全長(zhǎng)序列，成功克隆ARRB1-EGFP真核表達(dá)載體，經(jīng)免疫印跡鑒定了ARRB1-EGFP融合蛋白的表達(dá)。并對(duì)比了ARRB1-EGFP與內(nèi)源ARRB1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的定位，這些結(jié)果表明成功構(gòu)建并表達(dá)了ARRB1-EGFP重組蛋白。本研究構(gòu)建的ARRB1-EGFP重組質(zhì)粒具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)選用帶有報(bào)告基因的pEGFPN1質(zhì)粒，可編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白，具有熒光強(qiáng)、分子量較小、對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒性、檢測(cè)方便、不影響目的基因的表達(dá)及其后續(xù)的生物活性等優(yōu)點(diǎn)；2)該質(zhì)粒具有Neo基因，可以采用G418來(lái)篩選已成功轉(zhuǎn)染了該質(zhì)粒的靶細(xì)胞。

本研究構(gòu)建的ARRB1-EGFP重組蛋白可用于體外或在體水平觀察ARRB1對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的影響，為探討ARRB1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的作用以及研究ARRB1新的相互作用蛋白及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of ARRB1-EGFP fusion protein and its expression in glioma cells

WEN Pu-shuai1, GAO Jing21Department of Pathophysiology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China;2Department of Ultrasound, The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

GAO Jing. Email: gaojinggg@163.com

Objective To construct the recombinant expression vector ARRB1-EGFP, identify its expression in cells, and lay foundations for further functional study. Methods The full gene sequence encoding human ARRB1 was obtained by RT-PCR and subcloned into the eukaryotic expression vector pEGFPN1. Recombinant expression vector, ARRB1-EGFP, was transformed into E.coli DH5α and screened by restriction enzyme digest, gel electrophoresis and DNA sequence. Then the expression vectors were transfected into HEK293 cells, and its expression products were detected by Western Blot. The subcellular localization between endogenous ARRB1 and ARRB1-GFP in the SNB19 cells was detected and compared by using immunofluorescence staining. Results ARRB1-EGFP fusion protein eukaryotic expression vector was successfully constructed, and identified by Western Blot. Localization of the fusion protein, ARRB1-GFP, was similar with that of the endogenous ARRB1. Conclusion ARRB1-EGFP fusion protein can be safely and efficiently transfected into HEK293 cells and SNB19.

ARRB1; vector construction; expression; fusion proteins

R 34

A

2095-5227(2014)10-1059-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.10.023

時(shí)間：2014-06-06 11:07

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140606.1107.002.html

2014-04-02

文普帥，男，碩士，講師。Email: wenpushuai@gmail.com

高靜，女，碩士，主治醫(yī)師。Email: gaojinggg@163.com