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    PPARγ C161T基因多態(tài)性表達(dá)與進(jìn)展性腦梗死相關(guān)性研究

    2014-07-07 15:47:01盧振產(chǎn)胡正剛王亞仙浙江省湖州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科湖州313000
    浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2014年10期
    關(guān)鍵詞:純合子等位基因進(jìn)展

    沈 雙 盧振產(chǎn) 胡正剛 王亞仙 浙江省湖州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 湖州 313000

    PPARγ C161T基因多態(tài)性表達(dá)與進(jìn)展性腦梗死相關(guān)性研究

    沈 雙 盧振產(chǎn) 胡正剛 王亞仙 浙江省湖州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 湖州 313000

    目的探討PPARγ C161T基因多態(tài)性及其表達(dá)與進(jìn)展性腦梗死的關(guān)系。方法進(jìn)展性腦梗死患者225例納入進(jìn)展組,同期住院的非進(jìn)展性腦梗死患者225例為非進(jìn)展組。應(yīng)用多聚酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測兩組PPARγ基因C161T的基因型,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測PPARγ基因表達(dá)水平。結(jié)果進(jìn)展組和非進(jìn)展組患者PPARγ C161T基因多態(tài)性頻率無明顯差異(P>0.05)。入院時、入院后72h以及發(fā)病后4周,攜帶C等位基因腦梗死患者的PPARγ表達(dá)量均低于攜帶T基因的腦梗死患者(P<0.01),并且在攜帶C等位基因患者中進(jìn)展組PPARγ表達(dá)量低于非進(jìn)展組(P<0.01)。與入院時比較,入院后72h以及發(fā)病后4周各基因型的PPARγ表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。結(jié)論P(yáng)PARγC161T基因多態(tài)性的表達(dá)可能與進(jìn)展性腦梗死的發(fā)生有關(guān)。

    PPARγ基因;進(jìn)展性腦梗死;單核苷酸多態(tài)性

    進(jìn)展性腦梗死(progressive ischemic stroke,PIS)是缺血性腦卒中的一種,約占所有缺血性腦卒中的20%~40%,屬于難治性腦血管疾病,研究顯示進(jìn)展性腦梗死的致殘率以及病死率較非進(jìn)展性腦梗死增加近4倍[1-2]。研究表明,動脈粥樣硬化、血管炎癥及其相關(guān)的不穩(wěn)定斑塊與進(jìn)展性腦梗死密切相關(guān)[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome Proli-feratoractivated receptors gamma,PPARγ)在動脈粥樣硬化、炎癥、血管重構(gòu)方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。PPARγ可能通過對血管動脈粥樣硬化以及炎癥等的調(diào)節(jié),從而影響進(jìn)展性腦梗死的發(fā)生[5]。本研究旨在探討PPARγ C161T基因多態(tài)性及其PPARγ表達(dá)與進(jìn)展性腦梗死之間的相關(guān)性。

    1 臨床資料

    1.1一般資料 選擇2010年1月—2013年9月本院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者450例,其中進(jìn)展性腦梗死患者225例,男133例,女92例,年齡41~80歲,平均(65.36±12.25)歲;非進(jìn)展性腦梗死225例,男133例,女92例,年齡20~80歲,平均(66.42± 12.76)歲。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1995年第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[16];進(jìn)展性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)改良TOAST分型,把臨床動脈粥樣硬化血栓型(atllerothrombosis,AT)以及小動脈病變(small artery disease,SAD)這2類腦梗死患者納入進(jìn)展性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)[2,6-7],且入院后(或起病6h后)1周內(nèi)至少每24h進(jìn)行美國國立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)評分1次,并與入院后第1次NIHSS評分比較,任何一次NIHSS評分較首次評分增加≥2分,判定為進(jìn)展性腦梗死(NIHSS評分均為兩位醫(yī)師獨立評分后的平均分,以排除不同醫(yī)師評分的誤差)

    1.3納入標(biāo)準(zhǔn) ①年齡20~80周歲,急性起?。虎诎l(fā)病后48h內(nèi)入院;③符合腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)頭顱CT或MR證實;④符合進(jìn)展性腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)。

    1.4排除標(biāo)準(zhǔn) ①溶栓患者、改良TOAST分型的其他類型患者:心源性栓塞(cardioembolism,CE)患者:(高度懷疑心源性栓子來源:心房顫動病史、心電圖提示心房顫動、超聲心動圖檢查見附壁血栓及瓣膜贅生物),其他原因的中風(fēng)(stroke of other setermined etiology,SOD)如高凝狀態(tài)、血液系統(tǒng)疾病、動脈夾層、煙霧病、動脈炎、紅斑狼瘡等,不明原因的中風(fēng)(stroke of undetermined etiology,SUD);②抗血小板治療禁忌證的患者;③合并糖尿病患者正在服用噻唑烷二酮類糖尿病藥物(如吡咯列酮),嚴(yán)重心、肺、肝、腎疾病患者;④存在嚴(yán)重自身免疫性疾病、惡性腫瘤者;⑤患者及家屬不能配合。

    2 方 法

    2.1PPARγ C161T基因多態(tài)性檢測 選擇rs3856806為單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點,采用限制性酶切片段多態(tài)性的方法(PCR-RFLP)檢測SNPs的基因型。①DNA提取試劑盒提取基因組DNA。②PCR反應(yīng):上游引物:5’-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3’,下游引物:5’-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3’。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5min,94℃變性 45s,55℃復(fù)性1min,72℃延伸1min,35個循環(huán),最后 72℃延伸10min,基因的擴(kuò)增長度為200bp,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳30min,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR結(jié)果。③酶切體系:PCR產(chǎn)物長度為200bp,經(jīng)限制性內(nèi)切酶(EcoR72I酶)于恒溫37℃水浴8h后酶切,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳30min,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果,PCR產(chǎn)物經(jīng)過酶切后可出現(xiàn)三種情況:CC純合子型被酶切為120bp和80bp兩個條帶,TT純合子型不能被酶切仍為200bp一個條帶,CT雜合子型部分被酶最后表現(xiàn)為200bp、120bp和80bp三個條帶。DNA提取試劑盒、PCR Tap DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNTPMix脫氧核苷酸混合物(Promega公司);PCR引物由寶生物工程(大連Takara公司合成);淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll400,上海生物制品所);TRIzol試劑盒(Gibco公司),Hankc’s液(Sigma公司);PPARγ試劑盒(Genzyme公司)。

    2.2PPARγ表達(dá)水平檢測 ①人外周血單核細(xì)胞分離:患者于入院時、入院72h及發(fā)病4周分別抽取肘部靜脈血約10mL,30min內(nèi)分離出白細(xì)胞懸液,Hankc’s液稀釋,再用淋巴細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法分離周圍血單核細(xì)胞。②RNA提?。簩⒓?xì)胞粉碎后采用ELISA法測定細(xì)胞懸液PPARγ水平,操作嚴(yán)格按照PPARγ試劑盒說明書進(jìn)行。

    2.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5軟件包。計量資料以() 表示,采用t檢驗或方差分析,計數(shù)資料采用卡方檢驗或方差分析,若不符合正態(tài)分布的計量資料,采用對數(shù)轉(zhuǎn)換符合正態(tài)分布后再進(jìn)行相關(guān)檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1兩組PPARγC161T基因的基因型和等位基因分布 對本次研究選擇的樣本進(jìn)行卡方檢驗后符合Hardy-Weinberg平衡,說明本次研究樣本是來自隨機(jī)的群體,可以進(jìn)行等位基因關(guān)聯(lián)分析。進(jìn)展組各型等位基因頻率與非進(jìn)展組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

    表1 兩組PPARγ基因型及等位基因分布比較 例(%)

    3.2兩組PPARγ表達(dá)水平比較 入院時、入院后72h以及發(fā)病后4周,攜帶C等位基因患者中進(jìn)展組PPARγ表達(dá)量均低于非進(jìn)展組(P<0.01);但是進(jìn)展組T型基因攜帶者的PPARγ表達(dá)始終與非進(jìn)展組表達(dá)量相當(dāng)(P>0.50)。攜帶C等位基因腦梗死患者的PPARγ表達(dá)量低于攜帶T基因的腦梗死患者(P<0.01)。與入院時比較,入院后72h、發(fā)病后4周,進(jìn)展組與非進(jìn)展組兩種基因型攜帶者PPARγ的表達(dá)均明顯升高(P<0.01)。見表2。

    表2 兩組不同基因型不同發(fā)病時間PPARγ表達(dá)水平比較() ng/L

    表2 兩組不同基因型不同發(fā)病時間PPARγ表達(dá)水平比較() ng/L

    注:與C基因型比較,*P<0.01;與入院時比較,△P<0.01

    組別進(jìn)展組非進(jìn)展組n/例225 225入院時 入院后72h 發(fā)病后4周tP CC 168.32±74.35 221.91±77.35 7.49<0.01 TT+CT 223.61±59.46* 219.37±65.83* 0.68>0.50 CC 252.38±62.38△372.12±69.35△19.40<0.01 TT+CT 351.84±59.46*△348.56±61.22*△0.53>0.50 CC 507.64±72.16△606.51±68.31△14.99<0.01 TT+CT 575.91±71.33*△581.55±72.29*△0.89>0.50

    4 討論

    PPARγ作為過氧化物酶體增殖體激活受體家族的一員,PPARγ在脂肪、脾、腎上腺、肝、腸道、胃、胰腺、骨骼肌、巨噬細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá),PPARγ全程參與了動脈粥樣硬化以及影響機(jī)體局部和整體炎癥,既往的研究已經(jīng)證實在動脈粥樣斑塊中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)高表達(dá),而且在體內(nèi)粥樣硬化的炎性細(xì)胞-巨噬細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)高度表達(dá)的PPARγ,顯示PPARs所介導(dǎo)的炎癥與動脈粥樣硬化的發(fā)展有著密切聯(lián)系,更是直接提示PPARγ參與了粥樣斑塊的形成與發(fā)展[8]。C161T為位于PPARγ基因6號外顯子的一個重要突變,此位點野生型CC純合子占多數(shù),部分人群此基因位點突變?yōu)镃T雜合子甚至突變?yōu)門T純合子。既往的研究已經(jīng)表明攜帶有野生型CC純合子的人群較攜帶有突變T基因的人群更易發(fā)生頸動脈粥樣硬化及頸動脈狹窄[9],接下來的研究又進(jìn)一步證實攜帶有野生型CC純合子的人群不管其是否合并有糖尿病會比突變攜帶有突變T基因的人群更易發(fā)生血脂紊亂及罹患冠狀動脈粥樣硬化性疾病[10-12]。本研究結(jié)果不能顯示C等位基因增加腦梗死人群進(jìn)一步發(fā)生進(jìn)展性腦梗死的風(fēng)險,可能由于納入樣板量偏少的緣故尚不能發(fā)現(xiàn)在腦梗死患者中攜帶有野生型CC純合子基因型與腦梗死進(jìn)展性之間具有相關(guān)性。

    既往的研究已經(jīng)表明,PPARγ不僅能夠干預(yù)動脈粥樣硬化的過程,還對神經(jīng)細(xì)胞有直接保護(hù)作用。Shimazu等[13]研究表明,PPARγ的激活可增加銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn2SOD),清除自由基。PPARγ的激活可以保護(hù)腦缺血再灌注中神經(jīng)元損傷。另外,腦缺血后炎癥反應(yīng)的損傷作用已受到人們的關(guān)注。樹突狀細(xì)胞是一種重要的抗原提呈細(xì)胞,通過釋放細(xì)胞因子參與腦缺血后的炎癥損傷,PPARγ激動劑環(huán)格列酮可減輕OX2LDL誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞的表達(dá),抑制樹突狀細(xì)胞的入胞作用,減少樹突狀細(xì)胞所引發(fā)的免疫反應(yīng),減少腦缺血后的炎癥反應(yīng)[14]。Chang等[15]研究表明吡格列酮不依賴于低密度脂蛋白膽固醇的降低就逆轉(zhuǎn)斑塊的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,在進(jìn)展性及非進(jìn)展性腦梗死人群中攜帶有T等位基因患者的PPARγ表達(dá)水平明顯高于攜帶有C等位基因患者(P<0.01)。這從某種程度上說明了C161T基因多態(tài)性下的PPARγ的表達(dá)與腦梗死后發(fā)生進(jìn)展有一定的相關(guān)性,但是由于本實驗為一隊列設(shè)計研究,不能確定不同基因型的PPARγ的表達(dá)與進(jìn)展性腦梗死之間有無明確的因果關(guān)系,有待于進(jìn)一步的研究。

    本課題研究發(fā)現(xiàn),發(fā)病4周后經(jīng)積極的臨床治療進(jìn)展組和非進(jìn)展組C161T各基因型的PPARγ表達(dá)量明顯高于入院時水平(P<0.01),高度提示PPARγ在促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)方面可能起到了一定的作用,提示在腦梗死的超急性期或急性期PPARγ的表達(dá)可能與神經(jīng)功能有一定的相關(guān)性。是否PPARγ的表達(dá)始終能夠影響腦梗死的急性期或一直影響至恢復(fù)期仍不得而知,需進(jìn)一步的相關(guān)研究。

    本研究結(jié)果顯示,PPARγC161T基因多態(tài)性中C等位基因的PPARγ表達(dá)水平與進(jìn)展性腦梗死之間存在相關(guān)性。但本研究只是一個小樣本的隊列研究,尚不能明確PPARγ是否是進(jìn)展性腦卒中的一個獨立影響因素,需要進(jìn)一步的深入探索。

    [1]Birschel P,Ellul J,Barer D,et al.Progressing stroke:towards an internationally agreed definition[J].Cerebrovasc Dis,2004,17(2-3):242-252.

    [2]Barber M,Stott DJ,Langhorne P.An Internationally Agreed Defnition of Progressing Stroke[J].Cerebrovasc Dis,2004,18(3):255-256.

    [3]Del Bene A,Palumbo V,Lamassa M,et al.Progressive lacunar stroke:review ofmechanisms,prognostic features,and putative treatments[J].Int J Stroke,2012,Jun,7(4):321-329.

    [4]Olefsky JM.Find all citations by this author(default)Or filter your current search Glass CK.Macrophages,inflammation,and insulin resistance[J].Annual Review of Physiology,2010,72:219-246.

    [5]Srivastava RA.Evaluation of anti-atherosclerotic activities of PPAR-α,PPAR-γ,and LXR agonists in hyperlipidemic atherosclerosis-susceptible F(1)B hamsters[J].Atherosclerosis,2011,Jan,214(1):86-93.

    [6]Yamamoto Y,Ohara T,Hamanaka M,et al.Predictive factors for progressive motor deficits in penetrating artery infarctions in two different arterial territories[J].J Neurol Sci,2010,288(1/2):170-174.

    [7]Hoshino H,Takagi M,Yamamoto Y,et al.Neurological progression and clinical outcome of branch atheromatous disease(results from the J-BAD registry)[J].Rinsho Shinkeigaku,2010,50(11):919-920.

    [8]Stables MJ,Gilroy DW.Old and new generation lipid mediators in acute inflammation and resolution[J].Prog Lipid Res,2011,50(1):35-51.

    [9]閆振成,祝之明,沈成義,等.代謝綜合征PPAR-γC 161T基因多態(tài)性與頸動脈損害的相關(guān)研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(7):543-547.

    [10]Yilmaz-Aydogan H,Kurnaz O,Kurt O,et al.Effects of the PPARG P12A and C161T gene variants on serum lipids in coronary heart disease patients with and without Type 2 diabetes[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2011,358(1-2):355-363.

    [11]Jing Wan,Shixi Xiong,Shengping Chao,et al.PPARγ gene C161T substitution alters lipid profile in Chinese patients with coronary artery disease and type 2 diabetes mellitus[J].Cardiovascular Diabetology,2010,9:13.

    [12]Wu Z,Lou Y,Jin W,et al.The C161T polymorphism in the peroxisome proliferator-activated receptor gamma gene(PPARγ)is associated with risk of coronary artery disease:a meta-analysis[J].Mol Biol Rep,2013,40(4):3101-3112.

    [13]Shimazu T,Inoue I,Araki N,et al.A Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-{gamma}Agonist Reduces Infarct Size in Transient but Not in Permanent Ischemia[J]. Stroke,2005,36:353-359.

    [14]Luo Y,Liang C,Xu C,et al.Ciglitazone inhibits oxidizedlow density lipoprotein induced immune maturation of dendritic cells[J].J Cardiovasc Pharmacol,2004,44:381-385.

    [15]Chang K,F(xiàn)rancis SA,Aikawa E,et al.Pioglitazone Suppresses Inflammation In Vivo In Murine Carotid Atherosclerosis:Novel Detection by Dual-Target Fluorescence Molecular Imaging[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(10):1933-1939.

    Association of C161T Polymorphism on PPARγ Gene with Progressive Ischemic Stroke

    S HEN Shuang,LU Zhenchan,HU Zhenggang,WANG Yaxian.Department of Neurology,Huzhou Central Hospital of Zhejiang Province, Huzhou(313000),China

    ObjectiveTo investigate the relationship between C161T polymorphism on peroxisome proliferatoractivated receptor gamma(PPARγ)gene and progressive ischemic stroke.MethodsThe C161T variants on PPARγ gene of 225 patients with progressive ischemic stroke and 225 non-progressive ischemic stroke patients matched with age,gender,and past history of disease was examined by using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).The serum PPARγ was measured by ELISA.ResultsNo statistical differences in frequencies of genotype and allele was noted between the progressive and non-progressive ischemic stroke patients(P>0.05).At admission,72h after admission and 4 weeks after onset,the C allele carriers had lower levels of PPARγ,compared with the T allele carriers(P<0.01).In C allele carriers,the PPARγ expression in progressive ischemic stroke patients was significantly lower than that in non-progressive patients(P<0.01).Compared with baseline,the PPARγ expression significantly increased in each genotype at 72h after admission and 4 weeks after onset(P<0.01).ConclusionThe C161T polymorphism on PPARγ gene may be related to onset of progressive ischemic stroke.

    PPARγgene;progressive ischemic stroke;single nucleotide polymorphism

    2014-04-18

    修回日期:2014-06-06

    浙江省湖州市科技計劃項目(No.2012YS16)

    王亞仙,Tel:13757077279;E-mail:zclutcm@gmail.com

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