核桃青皮多糖超聲輔助提取工藝及抗氧化活性研究

呂建平　張直峰　聶倩　閆桂琴

摘要：以多糖得率為指標(biāo)，水料比、提取時間、提取溫度為考察因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對核桃（Juglans regia L.）青皮多糖超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，并對核桃青皮多糖清除羥基自由基和超氧陰離子自由基活性進行了分析。結(jié)果表明，核桃青皮多糖超聲輔助提取最佳工藝條件為：水料比18∶1（V∶m）、提取時間31 min、提取溫度80 ℃、提取2次，在此條件下多糖得率為9.02%；核桃青皮多糖對羥基自由基及超氧陰離子自由基均有一定的清除活性，但其清除作用小于維生素C。

關(guān)鍵詞：核桃（Juglans regia L.）青皮；多糖；超聲輔助提取；響應(yīng)面法；抗氧化活性

中圖分類號：S664.1；O629.12 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1148-05

多糖（Polysaccharide）是指聚合度超過10以上的多聚糖，是廣泛存在于動物、植物及微生物中的一類大分子化合物，具有許多重要的生物活性，如參與細胞骨架的構(gòu)成，同時它也是多種內(nèi)源性生物活性分子的組成成分[1]。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗腫瘤、抗衰老、抗感染、降血糖血脂、治療艾滋病等功效[2]，其免疫調(diào)節(jié)作用是主要作用，所以又叫免疫活性多糖[3]。目前，多糖已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要組成部分。核桃（Juglans regia L.）是我國重要的經(jīng)濟林樹種之一[4]，我國核桃栽培面積及產(chǎn)量均居世界首位。核桃富含蛋白質(zhì)、維生素、亞油酸等[5]。在食用和生產(chǎn)過程中，核桃利用部位主要為其種仁，大量的青皮被廢棄，但現(xiàn)有研究顯示核桃青皮中也富含許多生物活性成分[6]。因此，如能從核桃青皮中提取具有免疫活性的多糖，可實現(xiàn)資源化利用。本研究對核桃青皮多糖的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，并對其體外抗氧化活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

材料：核桃青皮2012年購于山西古縣，清洗干燥后粉碎，過60～80目篩，備用。

試劑：AB-8大孔吸附樹脂、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、鄰苯三酚、抗壞血酸，所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 參照劉巋等[7]的方法進行多糖的提取，核桃青皮樣品經(jīng)石油醚回流脫脂后，加入一定體積的蒸餾水（水料比為5∶1～25∶1，V∶m），水浴（50～90 ℃）超聲提?。?0～90 min），提取2次，過濾后合并濾液減壓濃縮，用Sevag法除去蛋白質(zhì)，3倍體積95%的乙醇沉淀多糖，真空干燥沉淀，即得到核桃青皮粗多糖。

1.2.2 多糖含量的測定 采用蒽酮-硫酸法測定多糖的含量[8]，以葡萄糖作為標(biāo)準品，采用紫外可見分光光度法在625 nm波長下測定吸光度，以吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖溶液標(biāo)準曲線，得到方程為Y=3.48X+0.000 8，R2=0.999 6。核桃青皮多糖得率為：

R= m1/m2×100%

式中m1為粗多糖中多糖質(zhì)量；m2為原料干重。1.2.3 超聲輔助提取核桃青皮多糖最佳條件的確定 根據(jù)水料比、提取時間、提取溫度3個單因素試驗所確定的水平范圍，應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件，根據(jù)Central-Composite中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，利用響應(yīng)面試驗結(jié)果，確定核桃青皮多糖的最佳提取條件，試驗具體因素與水平見表1。

1.2.4 核桃青皮粗多糖的精制 參照仰榴青等[9]、朱建飛等[10]的方法，準確稱取按照“1.2.1”中方法制備的核桃青皮粗多糖400 mg，溶于200 mL蒸餾水中，過AB-8大孔吸附樹脂柱，蒸餾水洗脫200 mL，流速1 mL/min。將純化后的多糖溶液濃縮干燥至恒重，用于抗氧化活性的分析。

1.2.5 核桃青皮多糖抗氧化活性的測定

1）清除羥基自由基活性的測定

采用水楊酸法[11，12]測定羥基自由基的清除率。在10 mL比色管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL和不同濃度的多糖或維生素C溶液2 mL，8.8 mmol/L H2O2溶液2 mL。充分混勻后于37 ℃水浴30 min，于波長510 nm處測定吸光度，以加蒸餾水為空白對照，用以下公式計算羥基自由基的清除率：

R=[（Ao-Ai）/Ao]×100%

式中，Ao表示空白對照的吸光度；Ai表示加入抗氧化劑體系的吸光度。

2）清除超氧陰離子活性的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[13]測定超氧陰離子的清除率。將50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）的緩沖液4.5 mL置于25 ℃水浴中預(yù)熱25 min，依次加入不同濃度的多糖或維生素C溶液各1 mL，2.5 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.4 mL?；靹蚝螅? min內(nèi)于波長325 nm處每隔30 s測定溶液的吸光度，計算鄰苯三酚溶液的吸光度隨時間的變化率K，以蒸餾水為空白對照，用以下公式計算超氧陰離子的清除率：

R=[（Ko-Ki）/Ko]×100%

式中，Ko表示加入蒸餾水空白對照的鄰苯三酚溶液的吸光度隨時間的變化率；Ki表示加入抗氧化劑體系的鄰苯三酚溶液的吸光度隨時間的變化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 水料比對核桃青皮多糖得率的影響 選擇

5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的水料比，60 ℃超聲提取30 min，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著水料比的增加，多糖得率先增大后減小。當(dāng)水料比為15∶1時，多糖得率達到最大。這可能是由于隨著提取體積的增加，后續(xù)濃縮、醇沉工藝的操作增多，損失了多糖。因此，水料比范圍選擇10∶1～20∶1為宜。

2.1.2 提取時間對核桃青皮多糖得率的影響 選擇水料比為15∶1，60 ℃超聲提取10、30、50、70、90 min，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著提取時間的延長，多糖得率先增加后減小，30 min時達到最大。這可能是由于超聲波可以加速細胞內(nèi)的多糖釋放到提取液中，前30 min破碎細胞中的大部分多糖釋放出來，多糖得率增加。但繼續(xù)延長提取時間多糖降解，多糖得率反而減小。因此，提取時間范圍選擇10～50 min為宜。

2.1.3 提取溫度對核桃青皮多糖得率的影響 選擇水料比為15∶1，在50、60、70、80、90 ℃條件下超聲提取30 min，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著提取溫度的增加，多糖得率迅速增大，當(dāng)溫度達到70 ℃后，多糖得率基本保持不變。因此，提取溫度范圍選擇60～80 ℃為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對核桃青皮多糖提取率的影響 選擇水料比為15∶1，70 ℃超聲提取30 min，在此條件下提取1、2、3、4、5次，結(jié)果見圖4。由圖4可知，提取2次以后，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率增加緩慢。因此，選擇提取2次為宜。

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定提取次數(shù)為2次，以水料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為自變量，以核桃青皮多糖得率為響應(yīng)值（R），進行響應(yīng)面分析試驗，結(jié)果見表2。利用Design-Expert 7.0軟件進行試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)分析，根據(jù)試驗結(jié)果建立的數(shù)學(xué)模型為R=8.254 91+0.539 00A+0.130 00B+1.237 00C+0.066 250AB+0.311 25AC-0.126 25BC-0.702 27A2-0.317 27B2-0.662 27C2。根據(jù)響應(yīng)面二次模型進行變異分析（Analysis of variance，ANOVA），結(jié)果見表3。從表3的分析結(jié)果來看，整體模型的P<0.000 1，表明該二次方程模型極顯著。水料比和提取溫度對多糖得率的影響達極顯著水平，提取時間對多糖得率的影響達顯著水平。在本試驗條件下，3個因素對多糖得率影響的大小程度為提取溫度、水料比、提取時間。除了二次項AB不顯著外，其他二次項都顯著。方程的失擬項不顯著，表明該方程對試驗擬合情況好，試驗誤差小。

模型R2=0.993 9，說明自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。R2Adj=0.988 5和R2Pred=0.932 3，表明試驗預(yù)測值和實際值基本相符。CV值為1.82%，表明試驗誤差小。以上結(jié)果表明，此回歸模型擬合程度良好，滿足試驗分析的要求。

各因素之間對多糖得率的交互影響見圖5-7。從圖5可以看出，提取溫度一定時，水料比和提取時間的交互作用對多糖得率的影響不顯著。在圖6中，響應(yīng)面曲線最為陡峭，表明提取時間一定時，水料比和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響極顯著。從圖7可以看出，當(dāng)水料比一定時，提取時間和提取溫度的交互作用對多糖得率的影響顯著。比較3個響應(yīng)面曲線可知，提取溫度對多糖得率的影響最大，水料比次之，提取時間相對影響最小。這與ANOVA分析結(jié)果相一致。

2.3 模型的驗證性試驗

通過Design-Expert 7.0軟件分析得到核桃青皮多糖超聲提取優(yōu)化后的條件為水料比18.05∶1，提取時間31.4 min，提取溫度80 ℃。在此條件下提取2次，預(yù)計多糖得率為9.09%。為了檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性，考慮到實際操作中的可行性，修正提取條件為水料比18∶1，提取時間31 min，提取溫度為80 ℃。在此條件下提取2次，進行3次平行試驗，實際測得的多糖平均得率為9.02%，模型預(yù)測值為9.09%，預(yù)測值與實際值相差較小，證明該模型得出的核桃青皮多糖提取的參數(shù)是可行的。

2.4 核桃青皮多糖的抗氧化能力

2.4.1 對羥基自由基清除能力的測定 核桃青皮多糖及維生素C對羥基自由基的清除作用見圖8?？梢钥闯?，核桃青皮多糖對羥基自由基有很明顯的清除作用，且隨著核桃青皮多糖和維生素C濃度的增加，清除率逐漸增加。在相同濃度下，其核桃青皮多糖對羥基自由基的清除率小于維生素C。

2.4.2 對超氧陰離子清除能力的測定 核桃青皮多糖和維生素C對超氧陰離子的清除作用見圖9。由圖9可知，隨著核桃青皮多糖和維生素C濃度的增加，核桃青皮多糖和維生素C對超氧陰離子的清除率增加，相同濃度下，維生素C對超氧陰離子的清除率高于核桃青皮多糖。

3 小結(jié)與討論

隨著植物次生代謝產(chǎn)物研究的發(fā)展，超聲波由于其獨特的機械效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)及空化效應(yīng)[14]已經(jīng)應(yīng)用到植物有效成分的提取中，特別在植物多糖的提取中已顯示出明顯的優(yōu)勢。本試驗采用超聲輔助提取工藝，獲得較好的效果。通過響應(yīng)面法分析獲得的核桃青皮多糖超聲輔助提取的最佳工藝條件為水料比18∶1，提取時間31 min，提取溫度80 ℃；提取2次時，核桃青皮多糖得率達到9.02%。與于翠蓮[15]研究的核桃青皮多糖熱水浸提工藝技術(shù)相比，具有提取時間短、多糖得率高的優(yōu)點。

羥基自由基是生物體內(nèi)毒性較大的自由基[16]。超氧陰離子自由基的毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因[13]。植物多糖作為一種無毒副作用的天然提取物，已有大量研究表明其具有一定的抗氧化作用。李利華[17]、Wang等[18]對百合、人參多糖抗氧化活性進行報道。本研究體外抗氧化活性結(jié)果表明，在本試驗條件下，核桃青皮多糖對羥基自由基的清除率和對超氧陰離子自由基的清除率不及維生素C，但核桃青皮多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基均有一定的清除作用，因此，可作為一種潛在的天然抗氧化劑運用在醫(yī)藥學(xué)中。

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