重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白生物仿制藥對大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療作用

洪 剛， 雷 云， 溫家明， 陳寶瓊， 盧 加， 李光飛， 謝秋玲， 熊 盛

(暨南大學(xué)生物醫(yī)藥研究院基因工程藥物國家工程研究中心，廣東 廣州 510632)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 (rheumatoid arthritis，RA)是一種以對稱性、進(jìn)行性為主要表現(xiàn)的全身慢性自身免疫病，可引起全身關(guān)節(jié)腫痛、功能障礙，晚期可破壞全身關(guān)節(jié)、引起強(qiáng)直和畸形障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，已成為主要的致殘性疾病之一［1-2］.近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞炎癥因子共同參與其病理過程，其中腫瘤壞死因子 TNF-α是關(guān)節(jié)軟骨破壞最重要的炎癥介質(zhì)之一，是RA發(fā)病機(jī)制中居中心地位的促炎癥細(xì)胞因子［3-4］.

TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌的具有多種免疫調(diào)節(jié)作用的促炎細(xì)胞因子，高表達(dá)于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的血清和滑液中［5-6］，大量滑膜細(xì)胞表達(dá)P55或P75 TNF受體［7-8］.因此，如何降低TNF-α在RA中的表達(dá)水平已經(jīng)成為治療RA的關(guān)鍵.隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物技術(shù)藥物已成為治療風(fēng)濕病的強(qiáng)力有效藥物［9-12］.由于Enbrel的專利在國外已經(jīng)過期，而需求量非常高.因此，希望研發(fā)并生產(chǎn)TNFR-Fc融合蛋白的生物仿制藥，代替Enbrel從而滿足市場的需求.本實驗旨在研究應(yīng)用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)的治療作用及其可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)實驗動物 SPF級Wistar大鼠36只，雄性，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015.于暨南大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為:遵循SPF級動物飼養(yǎng)條件，清潔通風(fēng)環(huán)境，濕度(50±5)%，室溫(23±1)℃，水食自取，動物福利完全按照國際相關(guān)實驗法規(guī)實施.

(2)試劑與儀器 可溶性重組人腫瘤壞死因子受體的融合蛋白 (rhu-TNFR-Fc)由本實驗室自制;Enbrel購自惠氏公司，批號為 F85516;弗氏完全佐劑(CFA)購自美國Chondrex公司，批號為120212;水合氯醛購自成都市科龍化工試劑廠，生產(chǎn)批號為:20120611;批號為 R130730-12a大鼠 TNF-α ELISA試劑盒、批號為 R130730-07a大鼠 IL-1β ELISA試劑盒、批號為 R130730-06a大鼠 IL-6 ELISA試劑盒及批號為R130730-04a大鼠IL-10 ELISA試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司.全自動酶標(biāo)儀(Thermo multiskan MK3);細(xì)胞培養(yǎng)恒溫箱(New Brun Swick，Galaxy 170S);離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5415R);101-101電子液晶顯示游標(biāo)卡尺為廣陸數(shù)字測控股份有限公司產(chǎn)品;YLS-6B智能熱板儀為安徽正華生物儀器有限公司產(chǎn)品.

1.2 方法

(1)動物分組 將36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組6只.設(shè)生理鹽水空白對照組，陰性對照組(生理鹽水，AA+NS)，陽性對照組Enbrel組(給藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.25 mg/kg，AA+Enbrel)，rhu-TNFR-Fc給藥組(AA+rhu-TNFR-Fc):低質(zhì)量分?jǐn)?shù)組(1.125 mg/kg)，中質(zhì)量分?jǐn)?shù)組(2.25 mg/kg)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組(4.5 mg/kg).實驗開始第1天，除正常對照組，將其余5組的所有Wistar大鼠進(jìn)行弗氏完全佐劑免疫法，即給每只大鼠的左后足皮內(nèi)注射0.1 mL的弗氏完全佐劑質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL致炎.

(2)給藥方案 致炎后第12天按照分組開始皮下注射給藥，每隔3 d給藥1次，共給藥3次，每100 g體質(zhì)量給藥均為0.1 mL.

(3)建立大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型的觀察指標(biāo)

①大鼠體質(zhì)量和足底足墊厚度的測量 于致炎后第13，14，16，18，20，22，24，26 天測量所有大鼠的體質(zhì)量，檢測所有大鼠非致炎足足底足墊厚度.

②關(guān)節(jié)炎指數(shù)數(shù)(arthritis index，AI)評分 從致炎后第13天起，每2 d進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分，觀察每組大鼠的繼發(fā)病變.每只足爪的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)為:0:正常;1:踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹;2:踝關(guān)節(jié)到跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)紅斑和輕微腫脹;3:踝關(guān)節(jié)到跖趾關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹;4:踝關(guān)節(jié)到趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和重度腫脹.每只大鼠最多評12分.

③血清中 IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10 檢測 于致炎后第27天在大鼠腹動脈取血，分離血清，-20℃凍存?zhèn)溆?采用雙抗夾心ELISA法檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10 的含量.

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均用(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示.利用SPSS軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析.以P值＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 TNFR-Fc對AA大鼠體重的影響

從大鼠致炎開始，每天觀察大鼠全身變化，每隔2天稱量大鼠體重.正常組大鼠皮毛光澤，精神活潑，飲食正常.與正常大鼠相比，AA大鼠模型組在炎癥反應(yīng)期倦怠、體質(zhì)量減輕，有部分大鼠耳部、尾部可見有紅腫，結(jié)節(jié)，致炎足出現(xiàn)嚴(yán)重潰瘍，非致炎足出現(xiàn)紅腫;有部分大鼠出現(xiàn)輕微潰瘍，皮毛暗淡無光澤、大鼠爬行困難、納食減少、體重增長減慢.TNFR-Fc及Enbrel治療組的大鼠較活躍，進(jìn)食情況較好，與陰性對照組比較，體質(zhì)量持續(xù)增加(P＜0.05)，各組大鼠體質(zhì)量增長情況(圖1).

圖1 TNFR-Fc對AA大鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effcets of TNFR-Fc on weight change in AA rats

2.2 TNFR-Fc對AA大鼠繼發(fā)性炎癥的影響

AA模型組大鼠右后足跖在致炎后第18天達(dá)到峰值，其后逐漸消退.與AA模型組相比，TNFR-Fc組大鼠從致炎后第14天開始發(fā)揮療效，TNFR-Fc中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組可明顯抑制AA大鼠的繼發(fā)性足腫脹.隨著TNFR-Fc濃度增大，抑制繼發(fā)性足腫脹作用增強(qiáng)，與陰性對照組比較，以高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組(4.50 mg/mL)作用最為明顯 (P ＜0.05)，且比 Enbrel組的治療效果更明顯.在致炎后第16天，TNFRFc中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)組對AA大鼠繼發(fā)性病變有明顯的治療作用(圖2).

圖2 TNFR-Fc對AA大鼠足腫脹的影響Fig.2 Effcets of TNFR-Fc on paw swelling in AA rats

2.3 TNFR-Fc對AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分的影響

與模型組比較，AA模型組大鼠足爪分值較正常組增加，TNFR-Fc質(zhì)量濃度分別為 2.25、4.50 mg/mL可明顯抑制 AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分分值，TNFR-Fc 質(zhì)量濃度分別為 1.125、2.25、4.50 mg/mL在炎癥高峰期第14天開始起效 (P＜0.05或P＜0.01)，隨著 TNFR-Fc質(zhì)量濃度增大，AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分分值減小，且相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，TNFR-Fc比Enbrel的治療效果更為明顯(表1).

表1 TNFR-Fc對AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分(±s)的影響Table1 Effcets of TNFR-Fc on arthritis index( ± s)in AA rats

表1 TNFR-Fc對AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分(±s)的影響Table1 Effcets of TNFR-Fc on arthritis index( ± s)in AA rats

1)與空白對照組相比，P ＜0.01;與陰性對照組比較，2)P ＜0.05，3)P ＜0.01.

組別 n/只 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·kg-1)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)13 d 14 d 16 d 18 d 20 d 22 d 24 d 26 d陰性對照組60.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 AA+NS 6 4.0 ±0.421)4.3 ±0.451)5.7 ±0.391)6.7 ±0.381)4.2 ±0.511)4.0 ±0.481)4.0 ±0.491)4.2 ±0.521)AA+Enbrel 6 2.25 3.5 ±0.51 3.5 ±0.49 3.7 ±0.363)3.3 ±0.463)3.5 ±0.53 3.7 ±0.32 3.3 ±0.32 2.0 ±0.51 AA+rhu-TNFR-Fc 6 1.125(低) 3.5 ±0.48 3.7 ±0.45 4.2 ±0.482)4.0 ±0.473)3.8 ±0.42 3.8 ±0.46 3.8 ±0.46 3.8 ±0.42 2.25(中) 3.5 ±0.45 3.2 ±0.36 3.2 ±0.433)2.7 ±0.433)2.5 ±0.462)2.5 ±0.492)2.2 ±0.482)2.2 ±0.392)4.50(高) 3.5 ±0.52 2.8 ±0.43 2.7 ±0.363)2.3 ±0.383)1.8 ±0.393)1.8 ±0.443)1.2 ±0.483)1.0 ±0.513)

2.4 TNFR-Fc對血清 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響

采用酶聯(lián)免疫法ELISA，檢測AA大鼠血漿中的 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 水平.與正常組相比，AA模型組大鼠 IL-1β、TNF-α、IL-6含量明顯增高，IL-10含量明顯減少，TNFR-Fc質(zhì)量濃度為2.25、4.50 mg/mL 和 Enbrel能明顯降低 IL-1β、TNF-α、IL-6含量，提高 IL-10含量(P ＜0.05或 P ＜0.01)，且隨著TNFR-Fc質(zhì)量濃度增大，AA大鼠血漿中的IL-1β、TNF-α、IL-6 含量減少，IL-10 含量升高(圖3).

圖3 TNFR-Fc對血清IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 水平的影響Fig.3 Effects of TNFR-Fc on blood plasm concentration of TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-10 in rats

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎其發(fā)病原因和機(jī)制至今仍不明確，通過建立一個實用有效的動物模型是深入研究其發(fā)病機(jī)制和評價藥物療效的重要手段.建立RA動物模型的方法有多種，如TNF-α基因轉(zhuǎn)化動物關(guān)節(jié)炎、MRL/Ipr小鼠自發(fā)性關(guān)節(jié)炎、卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等，但均存在成功率低、模型建立時間長等缺點［13-15］，RA模型的建立及應(yīng)用尚不規(guī)范，其評價也不充分.本實驗通過采用弗氏完全佐劑(CFA)注射大鼠左后足跖皮下致敏，成功建立大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎AA模型.

研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群和多種細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用.其中，又以TNF-α作用最為突出.TNF-α的中和抗體能夠減少類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的一系列前炎性細(xì)胞因子，如 IL-1β、IL-6 以及 GM-GSF 等的產(chǎn)生［16-18］.陳國威等［19］以 MTX、來氟米特配合益賽普來治療RA，在不降低治療效果的前提下，減少益賽普的用量，從而顯著降低了治療費用，并避免了不良反應(yīng)的增加，但存在樣本量小、療程不夠長的缺陷.楊艷麗等［20］應(yīng)用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白聯(lián)合甲氨蝶呤短期治療治療銀屑病關(guān)節(jié)炎顯示可以幫助重癥患者安全渡過急性期，延緩疾病進(jìn)展及阻止關(guān)節(jié)破壞，避免長期應(yīng)用生物制劑導(dǎo)致的嚴(yán)重不良反應(yīng)，但關(guān)于其療效與安全性是否優(yōu)于單用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體抗體融合蛋白尚有待于進(jìn)一步臨床研究.而本實驗則以重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)為靶標(biāo)藥物，結(jié)果顯示，隨著rhu TNFR-Fc質(zhì)量濃度增大，可明顯增加AA大鼠的體重，還可明顯抑制AA大鼠的繼發(fā)性足腫脹，AA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎評分分值.證明rhu TNFR-Fc對AA大鼠模型具有明顯的治療作用.

IL-1β和IL-6均為促炎細(xì)胞因子，主要分別由由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用.而IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，發(fā)揮下調(diào)炎癥反應(yīng)和拮抗炎性介質(zhì)的作用.IL-10具有很強(qiáng)免疫抑制及免疫調(diào)控作用，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起重要作用，膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中IL-10水平升高，中和IL-10后關(guān)節(jié)炎加重，給予IL-10治療能明顯抑制關(guān)節(jié)的炎癥.本實驗采用雙抗夾心ELISA方法檢測大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10的含量.結(jié)果顯示，隨著rhu-TNFR-Fc質(zhì)量濃度的增加，IL-1β、TNF-α、IL-6細(xì)胞因子的水平逐漸降低，而IL-10細(xì)胞因子的水平卻逐漸升高.說明rhu TNFR-Fc對AA大鼠的治療作用是通過降低IL-1β、IL-6等前炎性細(xì)胞因子水平，增加IL-10抗炎性因子水平來發(fā)揮作用，從而消除滑膜細(xì)胞炎癥.而重組rhu TNFR-Fc在同一質(zhì)量濃度時治療效果優(yōu)于Enbrel組，其原因有可能是在由弗氏完全佐劑(CFA)建立的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，相較于Enbrel，重組rhu TNFR-Fc具有更好的特異性治療效果，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究.

綜上所述，rhu TNFR-Fc對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有明顯的治療作用，其治療機(jī)制可能是通過中和體內(nèi)過度表達(dá)的Th1細(xì)胞因子TNF-α，抑制其他炎性因子的產(chǎn)生，如IL-1β、IL-6等，提高抗炎因子IL-10的水平來發(fā)揮抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用.

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