柿葉黃酮對同型半胱氨酸誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響

李 穎毛瑞陽杜曉紅趙曉薇

1浙江醫(yī)院干部科 杭州 310013 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

柿葉黃酮對同型半胱氨酸誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的影響

李 穎1毛瑞陽2杜曉紅2趙曉薇2

1浙江醫(yī)院干部科 杭州 310013 2溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院

目的觀察柿葉黃酮對同型半胱氨酸誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，并與銀杏葉提取物EGb761進行比較。方法將體外培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2細(xì)胞）分成空白對照組、同型半胱氨酸組（Hcy）、Hcy+EGb761組（100mg/L）和Hcy+低、中、高（12.5、25、50μg/mL）劑量柿葉黃酮組，培養(yǎng)72h。應(yīng)用RT-qPCR方法評價各組IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定培養(yǎng)上清液中上述細(xì)胞因子的蛋白濃度。結(jié)果與空白對照組比較，同型半胱氨酸組細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中蛋白濃度明顯增加（P＜0.05）；與同型半胱氨酸組比較，Hcy+EGb761組和Hcy+低、中、高劑量柿葉黃酮組各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)及培養(yǎng)上清液中蛋白濃度均降低（P＜0.05），尤其是高劑量柿葉黃酮組結(jié)果與Hcy+EGb761組作用相似。結(jié)論柿葉黃酮能抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α，在一定濃度條件下其作用不亞于銀杏葉提取物。

小膠質(zhì)細(xì)胞；柿葉黃酮；同型半胱氨酸；白介素-1β；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一種含硫的非必需氨基酸，高同型半胱氨酸血癥被認(rèn)為在認(rèn)知功能損害、神經(jīng)元功能退化等多種疾病中起著不可忽視的作用，但機制尚未完全明了[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，在致炎因素作用下被激活為反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞，后者可分泌多種細(xì)胞因子而損害神經(jīng)元。實驗證實Hcy可通過激活NAD（P）H氧化酶產(chǎn)生活性氧簇，使MG活化增殖[2]。因此我們推測Hcy可能通過活化MG分泌多種細(xì)胞因子，如白介素-1（interleukin-1，IL-1）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）介導(dǎo)神經(jīng)毒理作用。

柿葉為柿樹科柿樹屬植物柿的新鮮或干燥葉，其中含有黃酮類、三萜類、酚類、香豆素、鞣質(zhì)、多糖、有機酸等多種化學(xué)成分[3]，具有降血糖、降壓、抗栓、抗氧化、抗腫瘤、抗突變等作用[4-5]。本實驗通過體外細(xì)胞培養(yǎng)，觀察柿葉的主要成分黃酮對Hcy誘導(dǎo)的MG細(xì)胞因子表達(dá)的影響，評價其神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2細(xì)胞）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心（編號：3111C0001CCC000063）。DL-Hcy購自美國Sigma-Aldrich公司（編號H4628，純度＞95%）；柿葉黃酮由腦心清片用干浸膏（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供）經(jīng)聚酰胺樹脂吸附分離而得，總黃酮類含量29.7%（HPLC法測得），用2%NaHCO3溶液加熱到80℃溶解成含藥物5mg/mL的溶液備用；銀杏葉提取物（EGb761）購自桂林思特新技術(shù)公司天然植物制品廠（批號：ST-1101，其中黃酮≥24%，內(nèi)酯≥6%）。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司，Trizol購自美國Invitrogen生命技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，ELISA試劑盒購自美國R&D公司。定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，酶標(biāo)儀和洗板機購自美國Thermo科技公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將BV-2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換1次培養(yǎng)液，2～3天傳代1次，實驗時取處于對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整BV-2細(xì)胞濃度為2×105個/孔，接種于12孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。分為空白對照組；Hcy組：Hcy用6‰的冰乙酸配置成0.025mmol/L的母液，每孔加入 2μL母液；Hcy+ EGb761組：再加入100mg/L的EGb761；Hcy+低、中、高劑量柿葉黃酮組：分別加入12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的柿葉黃酮；各組培養(yǎng)72h后收取細(xì)胞樣品。

1.3RT-qPCR檢測BV-2細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量 收集各組細(xì)胞，每孔加入500μL Trizol，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，根據(jù)Fermentas公司的M-MLV操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，用于定量PCR檢測目的基因的表達(dá)，并以β-Actin作為內(nèi)參對照。各基因引物序列及擴增長度見表1，定量PCR體系總體積20μL，包括2×SYBR Green Mix 10μL，上、下游引物和模板各1μL及ddH2O 7μL。在定量PCR儀上擴增：95℃預(yù)變性2min；95℃15s，59℃20s，72℃20s共40個循環(huán)；60～95℃之間檢測溶解曲線，每升高0.5℃檢測1次，共70個循環(huán)。用2-△△Ct法進行各基因表達(dá)的相對定量。

表1 各基因qPCR檢測引物信息及擴增長度

1.4ELISA檢測BV-2細(xì)胞細(xì)胞因子蛋白表達(dá)量

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，設(shè)計酶標(biāo)板布局，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作要求依次加樣、孵育、洗板、加酶標(biāo)抗體、孵育、洗板、加底物、孵育、終止反應(yīng)、酶標(biāo)儀比色等過程，檢測BV-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子蛋白分泌水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件，計量資料用（） 表示，組間計量資料的比較采用單因素方差分析，若差異有統(tǒng)計學(xué)意義，則采用t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1柿葉黃酮對細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，Hcy組培養(yǎng)72h后，IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)量均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；與Hcy組比較，Hcy+EGb761組和Hcy+柿葉黃酮各組上述三種細(xì)胞因子的表達(dá)量均有減少（P＜0.05），與Hcy+EGb761組比較，Hcy+低劑量柿葉黃酮組TNF-α和Hcy+中、高劑量柿葉黃酮組各因子mRNA表達(dá)量與之接近（P＞0.05），見表2。

表2 各組細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量比較（）

表2 各組細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與Hcy組比較，△P＜0.05；與Hcy+ EGb761組比較，#P＜0.05

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2.2柿葉黃酮對細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，Hcy組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6和TNF-α濃度明顯升高（P＜0.05）；與Hcy組比較，Hcy+EGb761組和Hcy+柿葉黃酮各組三種細(xì)胞因子濃度明顯降低（P＜0.05），且與Hcy+EGb761組比較，Hcy+中、高劑量柿葉黃酮組IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)量與之接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組細(xì)胞因子蛋白表達(dá)量比較（） pg/mL

表3 各組細(xì)胞因子蛋白表達(dá)量比較（） pg/mL

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與Hcy組比較，△P＜0.05；與EGb761組比較，#P＜0.05

組別空白對照組Hcy組Hcy+EGb761組Hcy+低劑量柿葉黃酮組Hcy+中劑量柿葉黃酮組Hcy+高劑量柿葉黃酮組n3 3 3 3 3 3 IL-1β 29.77±2.96 148.19±3.79* 31.73±2.57△84.63±9.12△#53.50±3.89△32.15±3.52△IL-6 46.10±4.34 154.29±1.47* 57.58±6.81△106.03±12.09△#76.90±3.79△72.74±12.91△TNF-α 256.36±1.82 463.73±2.81* 164.78±2.16△351.92±20.49△#291.95±12.21△#266.91±20.34△#

3 討論

同型半胱氨酸（Hcy）是一種存在于血液和組織中的含硫氨基酸，由甲硫氨酸去甲基化后形成。研究[6-8]表明，Hcy是認(rèn)知功能障礙的獨立危險因素，但具體作用機制尚不完全清楚。小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，約占腦實質(zhì)細(xì)胞總數(shù)的10%～15%，是目前公認(rèn)的對損傷和疾病進行反應(yīng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)細(xì)胞，其特征之一就是易被任何類型的損傷和疾病活化。諸多研究[9-10]表明，MG通過分泌包括IL-1β、IL-6和TNF-α在內(nèi)的一系列炎癥因子而參與阿爾茨海默病等多種認(rèn)知功能障礙性疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，一定濃度的Hcy可誘導(dǎo)MG表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α，基因和蛋白水平均高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示Hcy可活化MG并誘導(dǎo)其表達(dá)多種細(xì)胞因子，而這些細(xì)胞因子可能在Hcy對神經(jīng)系統(tǒng)損傷如認(rèn)知功能障礙中具有重要意義。無論是在體還是離體實驗都證實高濃度的Hcy能顯著減少抗氧化劑如還原型谷胱甘肽、過氧化氫酶的含量，明顯升高氧自由基、過氧化氫、丙二醛的含量，且在Hcy濃度升高的情況下對氧化應(yīng)激敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與DNA結(jié)合的活性明顯增強[11-12]，這些都可能是Hcy誘導(dǎo)MG表達(dá)細(xì)胞因子的重要原因。

銀杏葉提取物EGb761是目前公認(rèn)的具有抗氧化、清除自由基等作用的藥物，研究[13-14]表明，EGb 761可通過抗氧化作用降低NF-κB活性，進而減少Hcy誘導(dǎo)的MCP-1、LOX-1等表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物EGb761可抑制Hcy誘導(dǎo)MG表達(dá)的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α（P＜0.05），與以往的研究結(jié)果一致。

腦心清片是用柿葉醋酸乙酯浸出物制成的中藥制劑，含有黃酮、有機酸和香豆素類等化學(xué)活性成分，臨床上用于預(yù)防和治療冠心病、缺血性腦血管病及高血壓病等。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，腦心清及其有效成分柿葉黃酮可通過上調(diào)抗氧化基因bc1-2的表達(dá)、清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化改善神經(jīng)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腦缺血損傷和神經(jīng)保護等作用。此外，柿葉黃酮對實驗性糖尿病大鼠及小鼠的血糖均具有顯著降低作用，其中通過降低肝臟MDA含量、增強SOD活力等作用，從而增強機體抗氧化能力，清除氧自由基以解除自由基對肝臟和胰島β-細(xì)胞的損傷，促進肝臟功能的恢復(fù)和胰島β-細(xì)胞的修復(fù)和復(fù)生，可能是柿葉降血糖的機制之一[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)與銀杏葉提取物EGb761類似，一定濃度的柿葉黃酮亦能夠抑制Hcy誘導(dǎo)MG表達(dá)的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α，且高劑量組抑制效果不亞于EGb761，其機制可能與上述抗氧化等神經(jīng)保護作用有關(guān)。

總之，Hcy可以誘導(dǎo)MG分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，柿葉黃酮可抑制這一過程，為中藥柿葉黃酮的臨床應(yīng)用提供了新的思路。

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Flavone from Diospyros kaki Leaves Represses the Expression of Cytokines Induced by Homocysteine in Microglia

LI Ying1，MAO Ruiyang2，DU Xiaohong2，ZHAO Xiaowei2. 1 Zhejiang Hospital,Hangzhou（310013）,China; 2 The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

ObjectiveTo evaluate the effect of flavone from diospyros kaki leaves on the expression of interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in microgia（BV-2 cells）induced by homocysteine，and compared its effect with that of EGb761.MethodsThe BV-2 cells incubated in vitro were di vided into six groups：blank control group，homocysteine（Hcy）group，EGb761 group（100mg/L）and flavone from diospyros kaki groups of different concentration（12.5，25，50μg/mL）.After 72h incubation，the mRNA expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α was assessed by RT-qPCR and the protein of cytokines in supernatant was detected by ELISA.ResultsThe mRNA expression and supernatant protein of IL-1β，IL-6，TNF-α in Hcy group were significantly higher than those of control group（P＜0.05），but were significantly decreased in EGb761 group and flavone from diospyros kaki groups compared with those of Hcy group（P＜0.05）.Especially，both the mRNA expression and supernatant protein in higher concentration flavone from diospyros kaki leaf group were comparable to those in EGb761 group.ConclusionFlavone from diospyros kaki leaves can inhibit the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cultured BV-2 cells induced by Hcy.In a certain concentration，it was no less effective than EGb761.

microgia；flavone from diospyros kaki leaves；homocysteine；interleukin-1β；interleukin-6；tumor necrosis factor-α

2013-11-26

修回日期：2014-03-20

浙江省溫州市科技計劃項目（No.Y20100056）