鹽酸吡咯列酮對動脈粥樣硬化兔主動脈脂聯(lián)素表達的影響

潘軍強，姚曉偉，周 鑫，韓穩(wěn)琦，李國良，孫超峰

(1. 西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710061；2. 陜西省人民醫(yī)院心臟內(nèi)二科，陜西西安 710068)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)相關疾病是目前人群死亡的首位原因，在我國發(fā)病率、致殘率和死亡率呈逐年上升趨勢。目前，公認為AS是一種大、中型動脈血管的慢性非特異性炎癥病變[1]。脂聯(lián)素(adiponectin, APN)是脂肪組織所表達和分泌的一個與胰島素抵抗關系最緊密的特異性細胞因子[2]，可通過抑制單核巨噬細胞中清道夫受體-1的表達而抑制脂質(zhì)的聚集，使巨噬細胞對脂質(zhì)吞噬減少，不向泡沫細胞轉(zhuǎn)化[3]，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[4]。吡格列酮屬于噻唑烷二酮類藥物，是近年來備受推崇的一類治療糖尿病的新藥，相關研究表明其可通過激動過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ)上調(diào)APN的表達，抑制許多炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)出抗AS作用[5-8]。本研究以AS易感動物，遺傳性高脂血癥(watanabe heritable hyperlipidemic, WHHL)兔為研究對象，給予高膽固醇飲食同時建立動脈粥樣硬化模型后觀察新型噻唑烷二酮類藥物鹽酸吡格列酮對兔動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)ANP表達的影響，探討噻唑烷二酮類藥物抗動脈粥樣硬化的作用機制，為此類藥物用于人類動脈粥樣硬化的預防和治療提供研究基礎。

1材料與方法

1.1實驗動物及藥品本組選擇新西蘭兔36只，雄性，1月齡，體質(zhì)量1.3～1.6 kg，購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。實驗室適應性喂養(yǎng)普通飼料1周后，稱重，隨機分為3組：正常對照組12只，飼喂正常飼料120 g/d；高膽固醇飲食組12只，飼喂高膽固醇飼料120 g/d；高膽固醇飲食加吡咯列酮組12只，高膽固醇飼料120 g/d+吡格列酮8 mg/(kg·d)灌胃，喂養(yǎng)8周后處死每組動物。高膽固醇飼料按照西方飲食飼料配方：膽固醇2%，蛋黃粉5%，豬油8%，基礎飼料85%。鹽酸吡格列酮片(瑞彤)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H20040631，15 mg/片。生產(chǎn)批號：08042151。

1.2試劑及儀器脂聯(lián)素抗體(anti-adiponectin)，產(chǎn)品規(guī)格：濃縮液(1 mg/mL) 親和純化抗體，產(chǎn)品編號：bs-0471R，北京博奧森生物技術有限公司。抗體稀釋液，北京中杉金橋生物技術有限公司。PV-6000通用型二步法免疫酶標組織化學染色檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司。0.01 mol/L PBS緩沖液，北京中杉金橋生物技術有限公司。0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，北京中杉金橋生物技術有限公司。光學顯微鏡(BX-51型)Olympus，Japan。病理圖文分析系統(tǒng)PIPS2000，重慶天海醫(yī)療設備有限公司。

1.3標本取材及留取以上各組實驗動物分別在預定實驗終點給予耳緣靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉30 mg/kg全身麻醉后左心室取血5 mL并注入空氣20 mL空氣栓塞處死動物。血液注入不含抗凝劑普通試管，靜置后離心分離血清。立即開胸并剪開右心房，自左心室灌注福爾馬林固定主動脈；分離主動脈，取出從近主動脈弓部到髂動脈分叉處全部主動脈，清除血管外組織，生理鹽水沖洗，置于中性甲醛緩沖液中固定。

1.4Masson染色后的鏡下觀察通過Masson染色觀察動脈硬化分級：0級：正常血管；1級：少于50%的外膜受累，內(nèi)膜增生占管腔不超過20%；2級：50%～100%的外膜受累輕度纖維化，內(nèi)膜增生不超過管腔的20%；3級：100%外膜受累，中度纖維化。內(nèi)膜增生占管腔的20%～50%；4級：100%外膜受累，重度纖維化，內(nèi)膜增生達管腔的50%～80%；5級：全部管腔閉鎖。

1.5免疫組化特異性染色后的鏡下觀察免疫組織化學染色法觀察主動脈血管內(nèi)皮脂聯(lián)素表達水平。結果判定：血管壁脂聯(lián)素蛋白的表達陽性結果為血管壁染成棕黃色，顯微鏡顯影系統(tǒng)采集圖像，選擇血管壁隨機取3個視野(×400)，計算機自動測量并計算陽性信號積分吸光度(A)值。

2結果

2.13組AS斑塊面積的變化高膽固醇飲食加吡咯列酮組、高膽固醇飲食組AS斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義[(48.35±4.33)%vs. (0.00±0.00)%，(58.11±8.34)%vs. (0.00±0.00)%；P<0.01]；高膽固醇飲食加吡咯列酮組AS斑塊面積與動脈內(nèi)膜面積比值低于高膽固醇飲食組，差異有統(tǒng)計學意義[(48.35±4.33)%vs. (58.11±8.34)%；P<0.05]。

2.23組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比的比較高膽固醇飲食加吡咯列酮組與高膽固醇飲食組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高膽固醇飲食加吡咯列酮組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比低于高膽固醇飲食組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

表1 3組內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜/中膜厚度比的比較

與正常對照組比較，*P<0.05；與高脂飲食組比較，#P<0.05。

2.33組動脈壁及AS斑塊Masson染色的結果正常對照組動物主動脈硬化為0級，高膽固醇飲食組動物主動脈硬化4級以上，高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動脈硬化3～4級(圖1)。

2.43組脂聯(lián)素特異性免疫組織化學染色表達陽性面積比的比較高膽固醇飲食加吡咯列酮組、高膽固醇飲食組血管壁脂聯(lián)素蛋白表達A值均低于正常對照組，差異有顯著性(0.356±0.045vs. 0.543±0.073，0.278±0.083vs. 0.543±0.073；P<0.05)；高膽固醇飲食加吡咯列酮組血管壁脂聯(lián)素蛋白表達A值高于高膽固醇飲食組，差異有顯著性(0.356±0.045vs. 0.278±0.083；P<0.05，圖2)。

圖1 動脈壁及AS斑塊的組織、病理學改變

圖2 動脈壁及AS斑塊脂聯(lián)素蛋白的表達

3討論

APN是由脂肪細胞分泌的一種具有抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)胰島素抵抗及對血管內(nèi)皮細胞進行保護作用的特異性蛋白質(zhì)[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)：APN可使內(nèi)皮細胞減少對白介素-8和組織因子等炎癥因子的表達[10]，降低內(nèi)皮細胞和白細胞相互作用[11-12]，抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉(zhuǎn)化，減少對氧化的低密度脂蛋白攝取，降低泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積[13]，從而保護血管結構，抑制AS的發(fā)生、發(fā)展。以上研究清楚地描述了脂聯(lián)素延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展的機制并闡明脂聯(lián)素與AS密切相關。

PPAR-γ是由配體激活的核受體家族成員，通過與其配體結合來調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄水平。PPAR-γ的配體分為天然配體和合成配體，后者主要是噻唑烷二酮類藥物。目前，臨床上常用的是吡格列酮和羅格列酮兩種胰島素增敏劑。大量的實驗表明，PPAR-γ及其配體在巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞中均有表達，具有直接的血管效應，激活后可直接在血管壁水平發(fā)揮延緩AS發(fā)生、發(fā)展的作用。此外，PPAR-γ在調(diào)節(jié)脂聯(lián)素合成上起重要作用，應用噻唑烷二酮后脂聯(lián)素基因啟動子的活性明顯增強。

吡格列酮是人工合成的特異性PPAR-γ激動劑，也是臨床上用于治療2型糖尿病的口服降糖藥。近年來的研究表明在用吡格列酮治療2型糖尿病、胰島素抵抗患者后，血脂聯(lián)素也明顯升高[14]。本實驗結果顯示：正常新西蘭兔進食高膽固醇飼料后，主動脈血管壁脂聯(lián)素蛋白表達明顯降低，高膽固醇飲食加吡咯列酮組主動脈血管壁脂聯(lián)素蛋白表達高于高膽固醇飲食組低于正常對照組。即預防性服用吡格列酮可在一定程度上使主動脈血管壁脂聯(lián)素蛋白表達陽性面積水平上調(diào)。這與目前的相關報道一致，隨著對AS發(fā)病機制分子水平研究的不斷深入，有關吡格列酮對APN的影響及在抗AS中的作用將成為新的研究熱點。

參考文獻：

[1] HALARIS A. Inflammation, heart disease, and depression[J]. Curr Psychiatry Rep, 2013, 15(10):400-409.

[2] KOMURA N, MAEDA N, MORI T, et al. Adiponectin protein exists in aortic endothelial cells[J]. PLoS One, 2013, 8(8):71271-71276.

[3] OUCHI N, KIHARA S, ARITA Y, et al. Adipocyte-derived plasma protein, adiponectin, suppresses lipid accumulation and class A scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages[J]. Circulation, 2001, 103(8):1057-1063.

[4] ZIETZ B, HERFARTH H, PAUL G, et al. Adiponectin represents an independent cardiovascular risk factor predicting serum HDL-cholesterol levels in type2 diabetes [J]. FEBS Lelt, 2003, 545(2-3):103-104.

[5] KIM NH, KIM HY, AN H, et al. Effect of cilostazol on arterial stiffness and vascular adhesion molecules in type 2 diabetic patients with metabolic syndrome: a randomised, double-blind, placebo-controlled, crossover trial[J]. Diabetol Metab Syndr, 2013, 5(1):41-49.

[6] PASERI V, WU H, WILLERSON JT, et al. Modulation of vascular inflammationinvitroandinvivoby peroxisome peroliferator-activated receptor-γ activators[J]. Circulation, 2000, 101(3):235-238.

[7] MATTU HS, RANDEVA HS. Role of adipokines in cardiovascular disease[J]. J Endocrinol, 2013, 216(1):T17-36.

[8] KWON H, PESSIN JE.Adipokines mediate inflammation and insulin resistance[J]. Front Endocrinol, 2013, 4(1):71-84.

[9] VAIOPOULOS AG, MARINOU K, CHRISTODOULIDES C, et al. The role of adiponectin in human vascular physiology[J]. Int J Cardiol, 2012, 155(2):188-193.

[10] CHEN YJ, ZhANG LQ, WANG GP,et al. Adiponectin inhibits tissue factor expression and enhances tissue factor pathway inhibitor expression inhuman endothelial cells[J]. Thromb Haemost, 2008, 100(2):291-300.

[11] MAHADEV K, WU X, DONNELLY S, et al. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor- induced migration of human coronary artery endothelial cells[J]. Cardiovasc Res, 2008, 78(2):376-384.

[12] OUEDRAOGO R, GONG Y, BERZINS B, et al. Adiponectin deficiency increases leukocyte-endothelium interactions via upregulation of endothelial cell adhesion moleculesinvivo[J]. J Clin Invest, 2007, 117(6):1718-1726.

[13] TIAN L, LUO N, KLEIN RL, et al. Adiponectin reduces lipid accumulation in macrophage foam cells[J]. Atherosclerosis, 2009, 202(1):152- 161.

[14] COMB TP, WAGANER JA, BERGER J, et al. Induction of adipocyte complement related protein of 30 kilodaltons by PPAR-gamma agonists: a potential mechanism of insulin sensitization[J]. Endocrinology, 2002, 143(3):998-1007.