上調(diào)MiR-145的表達(dá)對口腔癌細(xì)胞CAL27生物學(xué)特性的影響

邵 淵，白艷霞，權(quán) 芳，吳勝利

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.耳鼻咽喉科；2.肝膽外科，陜西西安 710061)

MicroRNA(MiRNA)為一大類基因負(fù)性調(diào)控因子，參與了包括細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等多種生理和病理過程[1]。有越來越多的證據(jù)表明，在多種人類惡性腫瘤中MiR-145具有抑癌作用[2]。但是，MiR-145在口腔癌發(fā)生過程中的作用仍不明確。本研究旨在研究口腔癌細(xì)胞CAL27與正?？谇火つぜ?xì)胞hNOK中MiR-145的表達(dá)水平，并探究MiR-145表達(dá)水平的變化對口腔癌細(xì)胞CAL27增殖、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1材料人口腔癌細(xì)胞CAL27，人口腔黏膜角化細(xì)胞hNOK均從西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)中心獲得。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamin2000，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測試劑盒、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測試劑盒，購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑購自大連TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒選自Toyobo公司；PCR試劑盒選自Fermentas公司；Bugle-Loop MiRNA聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自上海GenePharma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人口腔癌細(xì)胞CAL27、口腔黏膜角化細(xì)胞hNOK置于RPMI 1640培養(yǎng)基[含100 mL/L胎牛血清(FBS)]中在37 ℃下常規(guī)培養(yǎng)。

1.3RNA提取和實(shí)時定量PCR利用Trizol試劑從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA。利用PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，最終反應(yīng)體積為20 μL，其中包含500 ng RNA、0.5 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix和4 μL的5倍PrimeScript?緩沖液及1 μL反轉(zhuǎn)錄引物。PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測以評估MiR-145的表達(dá)。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算每份樣本中所含RNA的相對量。引物序列：MiR-145正向引物，5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAAT-3′，反向引物，5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.4瞬時轉(zhuǎn)染口腔癌細(xì)胞CAL27(1×106)置于100 mL/L胎牛血清(FBS)的1640培養(yǎng)液中，50 mL/L CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。用Lipofectamin2000試劑將MiR-145和MiR-145對照序列分別轉(zhuǎn)染至CAL27細(xì)胞，具體方法可參照Lipofectamin2000操作手冊。MiR-145和MiR-145對照序列由上海GenePharma公司合成，其序列分別為MiR-145：5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′；MiR-145陰性對照物5′-AGGUAGUGUAAUCGCCUUGTT-3′。陰性對照序列與人類基因組非同源。

1.5細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)瓶中用含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)待測細(xì)胞至1×106個，培養(yǎng)24 h后留取上清液，與含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液按1:3的比例混合，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用磷酸鹽緩沖液(PBS)配置瓊脂糖，105 ℃進(jìn)行消毒30 min后降溫至45 ℃。留取一份瓊脂糖溶液至10份培養(yǎng)液中，混勻后加至24孔板中。0.8 mL/孔。待軟瓊脂變硬后，將培養(yǎng)板置于37 ℃和50 mL/L CO2下培養(yǎng)。2周后，對集落進(jìn)行照相，并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。

1.6細(xì)胞周期分析轉(zhuǎn)染后72 h收獲細(xì)胞，并用PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗2次，然后置于冰上以700 mL/L乙醇固定至少30 min。接著用碘化丙啶溶液[含有50 μg/mL碘化丙啶、50 μg/mL RNase A(核糖核酸酶A)]、1 mL/L Triton-X和0.1 mmol/L EDTA進(jìn)行細(xì)胞染色。利用流式細(xì)胞儀，根據(jù)DNA含量，通過FACS分析細(xì)胞周期。

1.7細(xì)胞凋亡分析將細(xì)胞由MiR-145和陰性對照序列轉(zhuǎn)染24 h，轉(zhuǎn)染后于48 h收獲細(xì)胞，并用500 μL結(jié)合緩沖液進(jìn)行再懸浮。在細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin-V-FITC和碘化丙啶，并于室溫下培養(yǎng)20 min。在流式細(xì)胞儀上分析染色的細(xì)胞。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包。各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或百分?jǐn)?shù)表示。根據(jù)數(shù)據(jù)特點(diǎn)各參數(shù)之間的比較選用χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CAL27和hNOK中MiR-145的表達(dá)MiR-145在正?？谇火つぜ?xì)胞hNOK中的表達(dá)量顯著高于口腔癌細(xì)胞CAL27(0.809±0.124vs. 0.397±0.141) (P<0.05，圖1)。

圖1MiR-145在hNOK和CAL27中的表達(dá)水平

Fig.1 The expression of MiR-145 in hNOK and CAL27

*P<0.05vs. hNOK

2.2MiR-145抑制CAL27細(xì)胞生長通過集落形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MiR-145對CAL27細(xì)胞生長具有抑制作用。與MiR-145陰性對照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，MiR-145轉(zhuǎn)染細(xì)胞的集落數(shù)量明顯減少(179.2±28.7vs. 91.6±23.6)(P<0.05，圖2)。

2.3MiR-145誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞周期阻滯腫瘤細(xì)胞的生長抑制通常與伴發(fā)的細(xì)胞周期阻滯以及細(xì)胞死亡通路激活有關(guān)。因此，我們研究了細(xì)胞周期阻滯和凋亡對于所觀察到的MiR-145轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長抑制的促進(jìn)作用。如圖3所示，與對照組相比，MiR-145轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯，G1周期百分比從(66.57±1.4)%增至(76.78±1.8)%(P<0.05)。

圖2轉(zhuǎn)染MiR-145對口腔細(xì)胞癌CAL27集落形成的影響

Fig.2 Effects of MiR-145 transfection on colony formation of oral carcinoma cell CAL27

*P<0.05,vs對照組。

2.4MiR-145誘導(dǎo)CAL27細(xì)胞凋亡與MiR-145對照序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，MiR-145 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的凋亡(尤其是晚期凋亡)細(xì)胞數(shù)量增加[(10.3±1.7)%vs. (5.6±1.1)%，P<0.05，圖4]。

3 討 論

MicroRNA(MiRNA)是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，已發(fā)現(xiàn)和注冊的MiRNAs已達(dá)數(shù)千種。大量的研究表明，MiRNAs作為內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，參與并調(diào)控了細(xì)胞的增殖、凋亡及分化過程，作為原癌基因或抑癌基因參與腫瘤的形成與進(jìn)展[3]。MiR-145是MiRNAs大家庭中的一員，定位于5號染色體，長約4.09 kb，是腫瘤發(fā)生發(fā)展中的一個潛在的保護(hù)性MiRNA，可通過與靶基因mRNA3’UTR完全性互補(bǔ)或不完全性互補(bǔ)并降解靶基因mRNA或僅抑制其翻譯過程[4]，可顯著影響腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲及凋亡的過程[5]。

圖3轉(zhuǎn)染MiR-145對口腔細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞周期的影響

Fig.3 Effects of MiR-145 transfection on cell cycle of oral carcinoma CAL27

圖4轉(zhuǎn)染MiR-145對口腔細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞凋亡的影響

Fig.4 Effects of MiR-145 transfection on cell apoptosis of oral carcinoma CAL27

*P<0.05,vs.對照組。

關(guān)于癌細(xì)胞中 MiRNA 的表達(dá)譜變化及其在腫瘤發(fā)生中作用的研究越來越受到重視[6]，初步證明乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、前列腺癌等患者血清具有特定的MiRNA表達(dá)譜[7]，而MiR-145在上述腫瘤中表達(dá)均明顯下調(diào)[8]，說明MiR-145作為腫瘤相關(guān)基因在其發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。目前，MiR-145 在口腔癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究中的報(bào)道較少。為了明確MiR-145對口腔細(xì)胞癌增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，在本研究中，我們檢測口腔癌細(xì)胞CAL27和正?？谇火つぜ?xì)胞hNOK中的MiR-145表達(dá)，并探究在口腔癌發(fā)生過程中MiR-145所發(fā)揮的生物學(xué)功能。我們的數(shù)據(jù)顯示，與正?？谇火つぜ?xì)胞相比，口腔癌細(xì)胞CAL27中的 MiR-145表達(dá)顯著下調(diào)，提示在口腔細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制中MiR-145可能為潛在的抑癌因子。MiR-145的表達(dá)下調(diào)或沉默可能會消除腫瘤抑制作用，從而有助于口腔癌發(fā)生。因此，我們檢測了CAL27中 MiR-145 的假定腫瘤抑制功能。將MiR-145通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染至口腔癌細(xì)胞CAL27，通過與對照組相比，觀察其對細(xì)胞增殖、凋亡等特征的影響。在本研究中，CAL27細(xì)胞中的MiR-145恢復(fù)表達(dá)抑制了細(xì)胞的集落形成，從而呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞生長抑制作用，同時MiR-145 恢復(fù)表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯和凋亡，這進(jìn)一步表明它具有腫瘤抑制功能。這些研究結(jié)果為后期進(jìn)一步確定其下游基因及開展口腔細(xì)胞癌的靶向基因治療提供了依據(jù)。

目前，口腔細(xì)胞癌的治療仍采取以手術(shù)為主的方法。由于頜面部血供豐富，術(shù)后出現(xiàn)的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移影響了腫瘤的預(yù)后。MicroRNA介導(dǎo)的腫瘤分子靶向治療將可能成為根治腫瘤的重要的發(fā)展方向。而MiR-145被認(rèn)為是一種具有腫瘤抑制作用的MiRNA，在肺癌、乳腺癌、骨肉瘤細(xì)胞、宮頸癌和膀胱癌等均呈低表達(dá)狀態(tài)。因此，通過上調(diào)MiR-145的表達(dá)，可能對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性發(fā)揮重要的作用。有研究表明，上調(diào)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-468和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞MiR-145的表達(dá)水平，可明顯下調(diào)細(xì)胞間粘合蛋白JAMA和actin結(jié)合蛋白fascin的表達(dá)水平，抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力[9]。通過上調(diào)MiR-145在乳腺癌細(xì)胞TP53的表達(dá)水平可促進(jìn)其凋亡特性[10]。上調(diào)MiR-145還可提高結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥5-氟尿嘧啶的敏感性[11]。本研究結(jié)果表明，上調(diào)MiR-145的表達(dá)對于口腔細(xì)胞癌的治療亦存在一定的潛在空間。

MiR-145作為腫瘤診斷的血清學(xué)標(biāo)記物逐漸受到重視。目前，腫瘤的診斷及臨床分期主要依賴于組織學(xué)及放射影像學(xué)方法。近期的實(shí)驗(yàn)研究表明，腫瘤組織的MiR-145可在血清的標(biāo)本中檢測。其優(yōu)點(diǎn)是獲得標(biāo)本簡單、無創(chuàng)、易得并可避免內(nèi)源性RNA酶的降解。已證明在多種惡性腫瘤患者中，其血清具有特定的MiRNA表達(dá)譜。

綜上所述，對MiR-145應(yīng)用于口腔癌的早期診斷及治療的研究具有廣泛的前景，對于MiR-145的分子表達(dá)及生物學(xué)意義的深入認(rèn)識，確定其調(diào)控表達(dá)的分子機(jī)制，對于口腔癌乃至其他惡性腫瘤的診治具有深遠(yuǎn)的意義。

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