陜西人群環(huán)氧化酶-2(COX-2)啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性及與結(jié)直腸癌易感性的關(guān)聯(lián)研究

李紅霞，郭秦樂(lè)，周 博，和水祥

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1. 第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；2. 生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西西安 710061)

環(huán)氧化酶(cyclooxygenase-2, COX)是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶。COX作為合成前列腺素E2過(guò)程中的重要限速酶，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要調(diào)節(jié)作用。目前相關(guān)研究已證實(shí)，COX-2在結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中均有過(guò)表達(dá)，COX-2過(guò)表達(dá)參與細(xì)胞增殖、血管形成、腫瘤轉(zhuǎn)移及抑制細(xì)胞凋亡等多種病理過(guò)程[1-2]。

CRC是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。研究表明，基因的遺傳多態(tài)性是導(dǎo)致不同個(gè)體對(duì)環(huán)境因素反應(yīng)性差異并引發(fā)CRC的重要原因，而COX-2基因多態(tài)性作為一個(gè)潛在因素影響著CRC的進(jìn)展及治療[3]。因此，探討COX-2啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性與CRC發(fā)生的相關(guān)性有重要的理論意義。本研究采用病例-對(duì)照的方法，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)陜西人群COX-2基因rs2745557和rs20417位點(diǎn)的基因多態(tài)性與CRC發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行研究，旨在探討COX-2基因多態(tài)性與CRC易感性及發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1主要試劑DNA提取試劑盒購(gòu)自中國(guó)天根生化科技(北京)有限公司；引物由上海Sangon Biotech股份有限公司合成；DNA聚合酶由大連TaKaRa公司提供；限制性內(nèi)切酶AciⅠ和Taqα購(gòu)自美國(guó)NEW ENGLAND BioLabs公司；50 bp marker購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司。

1.2病例與分組2011年10月至2013年6月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)并經(jīng)病理確診的CRC患者198例設(shè)為病例組，所入組患者長(zhǎng)期居住地為陜西省西安市及周邊縣、市，均為首次住院手術(shù)，既往未發(fā)現(xiàn)腫瘤病史，未行相關(guān)的放療及化療。男107例，女91例，年齡36～80歲，中位年齡60歲，其中結(jié)腸癌93例(46.96%)，直腸癌105 例(53.03%)。臨床分期采用國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)1987年的TNM分期法，Ⅰ～Ⅱ期患者111例(56.06%)，Ⅲ～Ⅳ期患者87例(43.94%)；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為116例(58.6%)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為82例(41.4%)。采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抽取200名同期到醫(yī)院參加健康體檢的志愿者為健康對(duì)照組，男112例，女98例，年齡35～76歲，中位年齡65歲，所選病例組及對(duì)照組均來(lái)自陜西西安市及周邊市縣。

對(duì)研究人群的基本資料如吸煙、飲酒、飲食習(xí)慣、精神狀況、腫瘤家族史等進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查并收集資料。收集研究人群的CRC的病理資料。

1.3標(biāo)本采集及基因組DNA提取經(jīng)研究對(duì)象知情同意后，采集靜脈血3 mL于EDTA抗凝管中，離心去血清后在剩下的細(xì)胞中加入300 mL人紅細(xì)胞裂解液，混勻震蕩3 min溶解紅細(xì)胞，離心30 s沉淀白細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后按TIANGEN公司說(shuō)明書提取DNA。

1.4COX-2基因多態(tài)性檢測(cè)采用PCR-RFLP技術(shù)分析COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)的位點(diǎn)rs20417 G/C及rs2745557 G/A位點(diǎn)的基因多態(tài)性. PCR擴(kuò)增的引物序列依次為：COX-2 rs20417 primer F：5′-TTTAGCGTTTGTCCATCAGAAG-3′，R：5′-GGGGC-GAGTAAGGTTAAGAAA-3′；COX-2 rs2745557 primer F：5′-TCAGCCATACAGGTGAGTACC-3′，R：5′-CTGGGAGCAGGAAAGAACTG-3′。2個(gè)PCR反應(yīng)體系均為50 μL，包括以下組分：10×Buffer 5.0 μL，MgCl23.0 μL，dNTPs 4.0 μL，上下游引物各4.0 μL，DNA聚合酶10 U，模板50 ng，滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足反應(yīng)體積至50 μL。擴(kuò)增條件為激活95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52.4 ℃(COX-2 rs2745557)或48.4 ℃(COX-rs20417)30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，之后72 ℃ 7 min，4 ℃。

PCR產(chǎn)物分別用AciⅠ和Taqα限制性內(nèi)切酶酶切，體系均為PCR產(chǎn)物10 μL，酶10 U，10×Buffer Tango 3.0 μL，滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足反應(yīng)體積至30 μL，水浴37 ℃過(guò)夜。30 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，同時(shí)選取10%樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

1.5COX-2多態(tài)性基因頻率與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析將COX-2多態(tài)性基因頻率及分布情況與研究人群的CRC的病理資料進(jìn)行相關(guān)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算各組等位基因和基因型頻率的分布,卡方檢驗(yàn)分析各組等位基因和基因型頻率分布的差異, 并通過(guò)比數(shù)比(OR)計(jì)算進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRC組與對(duì)照組的人群基本特征的比較CRC組年齡≥65歲的分布頻率高于健康對(duì)照組(54.0%vs. 37.5%，P<0.05)，有吸煙史、飲酒史及腫瘤家族史者的分布頻率均高于健康對(duì)照組(52.5%vs. 41.5%，P<0.05；39.4%vs. 29.0%，P<0.05；18.2%vs. 9.5%，P<0.05)，而各組間的性別構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1CRC組與對(duì)照組的人群基本特征的比較

Tab.1 Basic clinical characteristics in CRC group and control group[n(%)]

*P<0.05。

2.2COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)rs20417及rs2745557位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增的酶切分析COX rs20417位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物為357 bp，經(jīng)AciⅠ酶切電泳后可見(jiàn)產(chǎn)生111、245 bp 2個(gè)片段的GG型，產(chǎn)生111、245、357 bp 3個(gè)片段的GC型，及產(chǎn)生357 bp的CC型(圖1)。COX-2 rs2745557位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物為400 bp，經(jīng)Taqα酶切后可見(jiàn)僅有400 bp的AA基因型，含有161、238、400 bp 3個(gè)片段的GA基因型，含有161、238 bp 2個(gè)片段的GG基因型(圖2)。計(jì)算以上位點(diǎn)的多態(tài)性基因型分布，經(jīng)檢驗(yàn)對(duì)照組基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，可認(rèn)為研究人群來(lái)自于平衡群體，具有群體代表性。

圖1CRC組COX-2rs20417G/C位點(diǎn)基因多態(tài)性PCR-RFLP分析

Fig.1 SNPs of COX-2 rs20417 G/C by PCR-RFLP

圖2CRC組COX-2rs2745557G/A位點(diǎn)基因多態(tài)性PCR-RFLP分析

Fig.2 SNPs of COX-2 rs2745557 G/A by PCR-RFLP

2.3COX-2基因rs20417及rs2745557位點(diǎn)的基因型分布以及與CRC相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)性分析在控制了年齡、性別、吸煙、飲酒及家族史因素后，COX-2 rs20417 G/C 多態(tài)性位點(diǎn)的3種基因型GG、GC和CC在健康對(duì)照組中的分布頻率為29.0%、34.5%、36.5%，在CRC組的分布頻率為20.2%、39.4%、40.4%。以COX-2 rs20417 GG基因型(野生型)為對(duì)照，CRC組中的GC基因型(雜合突變型)和CC基因型(純合突變型)分布頻率與健康對(duì)照組比較差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而GC+CC基因型頻率在CRC的分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.61；95%CI: 1.02～2.56，表2)。

表2COX-2rs20417G/C與CRC的關(guān)系

Tab.2 Frequency distribution of COX-2 rs20417 G/C in CRC group and control group [n(%)]

在控制了年齡、性別、吸煙、飲酒及家族史因素后，COX-2 rs2745557 G/A多態(tài)性位點(diǎn)的3種基因型GG、GA和AA在健康對(duì)照組中的分布頻率為27.0%、35.0%、38.0%，在CRC組的分布頻率為16.2%、41.4%、42.4%。以COX-2 rs20417 GG基因型(野生型)為對(duì)照，CRC組中的GA基因型(雜合突變型)和AA基因型(純合突變型)分布頻率與健康對(duì)照組比較，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(GA型：OR=1.98，95%CI：1.15～3.40；AA型：OR=1.87，95%CI：1.09～3.19)，同時(shí)GA+AA基因型頻率在CRC的分布頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=1.92，95%CI：1.18～3.13，表3)。

表3COX-2rs2745557G/A與CRC的關(guān)系

Tab.3 Frequency distribution of COX-2 rs2745557 G/A in CRC group and control group [n(%)]

2.4COX-2rs20417及rs2745557位點(diǎn)的多態(tài)性基因頻率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CRC分期病理參數(shù)及發(fā)病部位的相關(guān)性分析COX-2 rs20417 G/C基因多態(tài)性分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率GG基因型9/82(11.0%)，GC基因型20/82(24.4%)，CC基因型53/82(64.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GG基因型Ⅲ～Ⅳ期占11/87(12.6%)，GC基因型Ⅲ～Ⅳ期占22/87(25.3%)，CC基因型Ⅲ～Ⅳ期占54/87(62.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，COX-2 rs20417 G/C基因多態(tài)性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚密切相關(guān)，而與CRC的發(fā)病部位沒(méi)有明顯相關(guān)性(P=0.27，表4)。

COX-2 rs20417 G/A基因多態(tài)性分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率GG基因型7/82(8.5%)，GA基因型20/82(24.4%)，AA基因型55/82(67.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；GG基因型Ⅲ～Ⅳ期占9/87(10.3%)，GA基因型Ⅲ～Ⅳ期占22/87(25．3%)，AA基因型Ⅲ～Ⅳ期占56/87(64.4%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，COX-2 rs2745557含有A等位基因的GA或AA基因型相對(duì)于GG基因型，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤分期差異顯著，而與發(fā)病部位無(wú)顯著相關(guān)(P=0.56，表5)。

表4COX-2rs20417G/C基因多態(tài)性分型與發(fā)病部位及病理參數(shù)的關(guān)系

Tab.4 Correlation of COX-2 rs20417 G/C SNP with lesion site and pathological parameters in colorectal cancer [n(%)]

表5COX-2rs2745557G/A基因多態(tài)性分型與發(fā)病部位及病理參數(shù)的關(guān)系

Tab.5 Correlation of COX-2 rs2745557 G/A SNP with lesion site and pathological parameters in colorectal cancer [n(%)]

3 討 論

COX-2是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵限速酶, 在腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中有顯著調(diào)控作用。近年來(lái)，吳齊兵等[4]研究顯示COX-2在包括CRC在內(nèi)的一些腫瘤中存在過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象，提示COX-2在CRC的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本文采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)198例陜西省CRC患者與200例健康人進(jìn)行病例-對(duì)照研究, 探討COX-2基因多態(tài)性與CRC的易感性關(guān)系, 并分析其與CRC患者病理特點(diǎn)的相關(guān)性。

國(guó)內(nèi)高婷花等[5]研究表明COX-2基因多態(tài)性與多種腫瘤易感性相關(guān)，且與CRC的易感性密切相關(guān)。國(guó)外大量研究發(fā)現(xiàn)，與基因型COX-2 rs20417 GG相比，基因型GC患結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)明顯上升[6]。本研究結(jié)果顯示陜西人群中COX-2啟動(dòng)子區(qū)rs20417位點(diǎn)的基因多態(tài)性與CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān), C等位基因是CRC的風(fēng)險(xiǎn)因素，與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致。

相關(guān)研究證實(shí),與基因型COX-2 rs2745557 GG相比，基因GA/AA患CRC的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，且A等位基因頻率與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分期顯著相關(guān)[7]；本研究證實(shí)陜西人群COX-2 rs2745557 G/A位點(diǎn)的基因多態(tài)性與CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，A等位基因是CRC的危險(xiǎn)因素，含有A等位基因的CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高，且與TNM腫瘤分期中Ⅲ～Ⅳ期密切相關(guān)，表明其可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

然而，一些國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)COX-2 rs20417 G/C多態(tài)性與結(jié)腸癌易感性并無(wú)直接聯(lián)系，表明COX-2基因多態(tài)性有種族差異，不同種族中基因型的頻率不同[8]。此外，COX-2作為腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，在包括肺癌、食管癌及胃癌等都得到了證實(shí)[9]。

人類COX-2基因是由604個(gè)氨基酸殘基編碼組成的多肽，在啟動(dòng)子區(qū)有一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列及3′端非編碼區(qū)與COX-2的表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。COX-2啟動(dòng)子含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，COX-2 rs2745557的G/A突變?yōu)?個(gè)c-Myb轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)了COX-2的啟動(dòng)子活性，從而提高其轉(zhuǎn)錄活性而促進(jìn)腫瘤形成。相關(guān)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)COX-2高表達(dá)可使金屬蛋白酶-2活性增加，膜金屬蛋白酶表達(dá)增多，有利于癌腫侵襲淋巴結(jié)而發(fā)生轉(zhuǎn)移[10]。本研究也顯示高表達(dá)基因型rs2745557(AG/AA)與CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能與這一機(jī)制相關(guān)。

結(jié)腸癌和直腸癌的發(fā)病機(jī)制尚存在差異，但在此研究中我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)COX-2基因多態(tài)性與發(fā)病部位存在顯著性差異，提示COX-2的表達(dá)對(duì)于CRC的發(fā)生沒(méi)有部位特異性，但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，本研究對(duì)陜西人群COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與CRC易感性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)研究，由于條件的局限性，仍存在有一些不足的地方。本研究雖然納入了CRC患者198例，但對(duì)進(jìn)行分層分析來(lái)看樣本量仍相對(duì)較少，可能會(huì)對(duì)研究的結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚。

總之，本研究結(jié)果表明陜西人群中COX-2 rs20417(G/C)位點(diǎn)多態(tài)性的C基因是CRC的危險(xiǎn)因素，COX-2 rs2745557(G/A)的AG/AA基因型是CRC的風(fēng)險(xiǎn)因素，且與CRC的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，兩個(gè)基因位點(diǎn)與發(fā)病部位無(wú)相關(guān)。此研究有助于闡明CRC易感性的分子基礎(chǔ)，為CRC的預(yù)防提供了理論依據(jù)。

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