谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系

吳水淼，王妨娥，郭素君，凌 敏，3

(1.新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832002；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團醫(yī)院呼吸科，新疆烏魯木齊 830001； 3.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸二科，新疆烏魯木齊 830001)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)的特征為不完全可逆的氣流受限。氣流受限通常和肺部異常炎癥反應(yīng)的有害顆?；驓怏w有關(guān)，具有高患病率、高致殘率、高病死率的特點。目前，COPD是位居世界第4位的死亡原因，并且在不久的將來其發(fā)病率、死亡率將持續(xù)上升[1]。

目前，多數(shù)學(xué)者認為，COPD與遺傳因素和環(huán)境因素及其相互作用有關(guān)。環(huán)境因素中吸煙是引起COPD的主要危險因素，然而，所有大量吸煙者中只有10%～20%發(fā)展成COPD[2]，這表明個體易感性或遺傳因素可能發(fā)揮作用。氧化酶-抗氧化酶失平衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可以損害氣道上皮組織和肺間質(zhì)，增強炎癥反應(yīng)，使促炎癥細胞因子基因上調(diào)，進而影響COPD的發(fā)生和發(fā)展。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1(glutathione S-transferase P1, GSTP1)是肺臟中重要的抗氧化酶，GSTP1基因第5外顯子的單核苷酸多態(tài)性(A/G)將影響到酶的抗氧化活性。關(guān)于GSTP1基因第5號外顯子多態(tài)性和COPD的研究仍有爭議[3-5]。

在本研究中，我們將分析GSTP1基因第5號外顯子多態(tài)性與新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對象選擇2011年至2013年在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸科住院治療的新疆維吾爾族COPD患者150例，均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標準[1]，選擇年齡、性別匹配的本院健康體檢者150例為對照組，且肺功能符合以下指標：第1秒用力呼氣容積/用力肺活量(FEV1/FVC)>70%，F(xiàn)EV1≥80%預(yù)計值，兩組人群均排除支氣管擴張、支氣管哮喘、肺部腫塊、結(jié)核性胸膜炎、胸廓畸形、肺間質(zhì)纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病及其他感染性疾病、外傷及自身免疫性疾病。兩組年齡及性別均無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。兩組對象均為無民族間遺傳干擾(與其他民族人無通婚情況)、無血緣關(guān)系的連續(xù)兩代及以上長期居住于新疆的維吾爾族人群，所有受試者均簽署書面的志愿書。該研究由本單位的倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1標本采集 在清晨空腹時采集研究對象的靜脈血2 mL，EDTA抗凝，將抗凝管上下輕輕顛倒8～10次，使血液與抗凝劑充分混合，-20 ℃低溫保存。

1.2.2基因組DNA的提取 應(yīng)用全血基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，按北京鼎國生物工程公司提供的說明書方法提取全血基因組DNA。提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR-RFLP方法檢測GSTP1基因多態(tài)性 依據(jù)文獻記錄[6]及自己設(shè)計合成GSTP1引物(北京鼎國生物工程公司)，GSTP1正向引物5′-GCTCCCCTCCACCCAACCCCAGG-3′，反向引物5′-TGCAGATGCTCACATAGTTGGTGTAGATGAGG-TAG-3′。PCR擴增反應(yīng)體系：10×PCR buffer(Mg2+free)2 μL，25 mmol/L MgCl 1.5 μL，10 mmol/L dNTP混合物2 μL，10 μmol/L上游引物0.5 μL，10 μmol/L下游引物0.5 μL，Taq酶5 U，50 ng/μL人基因組DNA 1 μL，DMSO 1 μL，ddH2O補足20 μL；所用試劑均購置于北京鼎國生物工程公司。

PCR反應(yīng)循環(huán)程序：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s，65 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，63 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，61 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，59 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，57 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，53 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；95 ℃ 30 s，51 ℃退火35 s，72 ℃ 40 s，共2個循環(huán)；72 ℃ 5 min，1個循環(huán)；最后4 ℃保存。

通過20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，確定PCR產(chǎn)物擴增出目的條帶的質(zhì)量。

1.2.4擴增片段的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)分析 用內(nèi)切酶AccⅠ對PCR產(chǎn)物進行消化反應(yīng)。反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物2 μL，10×buffer 1 μL，內(nèi)切酶8 U，用雙蒸水補足至10 μL，37 ℃水浴10 h。

酶切產(chǎn)物用33 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析直接計數(shù)法計算等位基因及基因型頻率；采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。研究對象與基因遺傳平衡規(guī)律(Hardy-Weinberg平衡)的符合程度采用χ2檢驗分析；計量資料以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，多因素調(diào)整采用Logistic回歸分析，計算比值比(odds ratios, OR)和95%可信區(qū)間 (confidence intervals, CI)用來檢測GSTP1基因多態(tài)性和COPD的相關(guān)性。所有統(tǒng)計均為雙側(cè)，顯著性檢驗水準取α=0.05。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1COPD組與對照組一般資料的比較兩組資料在性別和年齡方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(男∶女=137∶13、141∶9；平均年齡(歲)：56.5±15.1、54.4±12.3)，兩組間吸煙指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組間FEV1預(yù)計值及FEV1/FVC差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2GSTP1基因第5外顯子的PCR-RFLP結(jié)果提取的DNA經(jīng)過PCR反應(yīng)擴增出GSTP1基因，基因片段大小約為139 bp(圖1)。

圖1PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

Fig.1 The electrophoretogram of PCR amplification product

M：50 bp marker；1～8：PCR產(chǎn)物，大小為139 bp。

GSTP1基因第5外顯子PCR-RFLP結(jié)果見圖2。經(jīng)PCR擴增后得到139 bp PCR產(chǎn)物，經(jīng)AccⅠ酶切后，純合野生型(AA)的PCR產(chǎn)物為139 bp，純合變異型(GG)的PCR產(chǎn)物被水解為107 bp片段，雜合變異型(AG)型酶切產(chǎn)物則為139、107 bp兩個片段。

圖2PCR-RFLP的電泳圖

Fig.2 The electrophoretogram of PCR-RFLP

M：50 bp marker；1、2、6、7、8、9、10：GSTP1基因純合野生型；3：雜合變異型；4、5：純合變異型。

2.3COPD組和對照組基因型和等位基因頻率的分布GSTP1第5號外顯子105位在兩組均以AA基因型為主，AG、GG基因型均較少，兩組間的基因型頻率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013，表1)。

GSTP1第5外顯子105位等位基因頻率在兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，其中G等位基因頻率在COPD組的頻率(18.7%)明顯高于正常對照組(8.3%，表1)。

表1兩組GSTP15號外顯子105位氨基酸基因型分布及比較

Tab.1 Comparison of the distribution of 105 amino acids genotype of exon 5 of GSTP1 in the two groups

組 別例數(shù)基因型頻率AAAGGG等位基因頻率AGCOPD組150113(75.3%)18(12.0%)19(12.7%)244(81.3%)56(18.7%)對照組150132(88.0%)11(7.3%)7(4.67%)275(91.7%)25(8.3%) χ28.70213.716 P值0.0130.001

2.4GSTP1第5號外顯子105位氨基酸基因型及等位基因與COPD易感性的關(guān)系以研究對象是否患COPD為因變量，經(jīng)Logistic回歸分析(協(xié)變量包括年齡、性別、吸煙史、AA、AG、GG基因型)，經(jīng)調(diào)整年齡、性別和吸煙史后，COPD組GA等位基因頻率(18.7%)高于對照組(8.3%)，可能與COPD的發(fā)病風(fēng)險有關(guān)(OR=2.525，95%CI=1.528～4.171)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，表2)。

表2維吾爾族人群中基因型及等位基因與COPD易感性的關(guān)系

Tab.2 Relationship of genotypes and alleles in the Uighur population with COPD susceptibility

基因及等位基因COPD組(n=150)對照組(n=150)POR95% CI基因型AA1131321AG18110.1080.5230.237～1.154GG1970.0120.3150.128～0.777等位基因G56251A2442750.0012.5251.528～4.171

3 討 論

在COPD的發(fā)病機制中氧化應(yīng)激和活性氧導(dǎo)致氧化-抗氧化失平衡起著重要的作用。GST作為其中的抗氧化酶在肺部起著保護作用，可以催化各種與還原型谷胱甘肽共軛的電化合物。GSTP1基因外顯子5存在多態(tài)性，外顯子5上為A到G的改變導(dǎo)致蛋白105位上的異亮氨酸(Ile)轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸(Val)，導(dǎo)致GSTP1基因活性缺失，使得毒物代謝不充分，這可能會導(dǎo)致氧化應(yīng)激[7]。

本研究首次檢測了新疆維吾爾族人群COPD患者和對照組的GSTP1的第5外顯子基因多態(tài)性，提供了新的維吾爾族人群的GSTP1基因多態(tài)性和COPD的易感性的關(guān)系的新證據(jù)。GSTP1第5外顯子的基因頻率在COPD組和對照組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013)。GSTP1第5外顯子A等位基因頻率在兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，其中G等位基因頻率在COPD組的頻率(18.7%)明顯高于正常對照組(8.3%)。這提示維吾爾族人GSTP1 5號外顯子G等位基因與維吾爾族人COPD有相關(guān)性。

在體外DNA表達研究中提示A到G置換能降低酶的活性。人類肺組織的研究發(fā)現(xiàn)GSTP1第5外顯子Val降低GSTP1活性[8]。一項包含1 098個受試者的有不同程度肺損害的大樣本研究，結(jié)果提示在有輕到中度吸煙者中攜帶GSTP1105位G等位基因的肺功能迅速下降[9]。本研究結(jié)果與多數(shù)研究一致[10-12]：Val105Val GSTP1和GSTM1純合缺失型及環(huán)氧化物水解酶為COPD的發(fā)展過程中的危險因素；而與HARRIES等[13-14]的結(jié)論相反。有Meta分析調(diào)查了與COPD相關(guān)的12個基因20個基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)GSTP1Ile105Val僅為亞洲人COPD的保護因素(OR=0.69; 95%CI=0.56～0.85)[15]。

總之，我們發(fā)現(xiàn)GSTP1基因等位基因G為新疆維吾爾族COPD的危險因素。本研究COPD患者和健康對照組的例數(shù)是相當(dāng)?shù)模M一步擴大樣本量有助于闡明本病的致病因素。維吾爾族GSTP1分布頻率不同于其他地域、種族或民族。本實驗數(shù)據(jù)為進一步研究維吾爾族人群中COPD的發(fā)病機制積累了資料和數(shù)據(jù)，也為研究維吾爾族人群中與GSTP1基因多態(tài)性相關(guān)的其他疾病提供了基礎(chǔ)。

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