圓紅冬孢酵母新穎脂肪酸合酶的重組表達(dá)、純化與活性檢測(cè)

朱志偉，張素芳，林心萍，劉武軍，趙宗保

1中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部，遼寧大連116023

2中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所大連潔凈能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(籌)，遼寧大連116023

3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049

圓紅冬孢酵母新穎脂肪酸合酶的重組表達(dá)、純化與活性檢測(cè)

朱志偉1,3，張素芳1,2，林心萍1,3，劉武軍1,2，趙宗保1,2

1中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部，遼寧大連116023

2中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所大連潔凈能源國(guó)家實(shí)驗(yàn)室(籌)，遼寧大連116023

3中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049

朱志偉,張素芳,林心萍,等.圓紅冬孢酵母新穎脂肪酸合酶的重組表達(dá)、純化與活性檢測(cè).生物工程學(xué)報(bào),2014,30(9): 1414?1423.

Zhu ZW,Zhang SF,Lin XP,et al.Expression,purification and characterization of a novel fatty acid synthase from Rhodosporidium toruloides.Chin J Biotech,2014,30(9):1414?1423.

脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A反應(yīng)生成脂肪酸，是油脂合成代謝途徑中最重要的酶之一。在高產(chǎn)油脂的圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides中發(fā)現(xiàn)了一種新穎的FAS，它含兩個(gè)亞基，與其他物種的FAS相比，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域組成，尤其是含兩個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域。由于ACP在脂肪酸合成反應(yīng)中起輔因子作用，推測(cè)多個(gè)ACP有利于提高FAS的催化活性，為研究該FAS的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征，構(gòu)建了表達(dá)FAS兩個(gè)亞基的載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)，含pET22b-FAS1和pET24-FAS2質(zhì)粒的重組菌株ZWE06可同時(shí)高表達(dá)兩個(gè)亞基，經(jīng)硫酸銨沉淀、蔗糖密度梯度離心和陰離子交換層析純化，得到的重組FAS比活力達(dá)到548 mU/mg。純化的FAS復(fù)合物可用于后續(xù)酶動(dòng)力學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)研究，且表達(dá)與純化方法的建立對(duì)研究其他ACP的功能具有參考價(jià)值。

圓紅冬孢酵母，脂肪酸合酶，過(guò)表達(dá)，純化，酶活性

近些年，隨著能源、環(huán)境與氣候問(wèn)題日益嚴(yán)峻，迫切需要開(kāi)發(fā)綠色的可再生能源，其中生物柴油是甘油三酯轉(zhuǎn)酯化得到的脂肪酸甲酯(或乙酯)[1]，與現(xiàn)有石化柴油非常相似，因此受到廣泛關(guān)注。目前，生產(chǎn)生物柴油的原料主要為植物油或廢棄食用油，其生產(chǎn)依賴(lài)植物油脂資源。盡管油脂是可再生資源，但主要用于食品。全世界年產(chǎn)油脂約1.67億t(2009年)，其中植物油1.42億t，但80%的油脂用于食品，少量用作動(dòng)物飼料，只有14%可作為油脂化工原料[2]。而越來(lái)越多的油脂被加工成生物柴油，導(dǎo)致油脂原料供應(yīng)不足，必須開(kāi)發(fā)新的油脂資源。

將廉價(jià)的生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化為油脂是其中一種可能的選擇[3]。微生物可將碳源轉(zhuǎn)化為油脂，作為能源物質(zhì)儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，其中部分微生物可積累超過(guò)自身干重20%的油脂，這些微生物被稱(chēng)為產(chǎn)油微生物(Oleaginous microbes)[4]。圓紅冬孢酵母Rhodosporidium toruloides可積累超過(guò)自身干重70%的油脂[5]，高密度發(fā)酵最高油脂產(chǎn)量達(dá)到78.7 g/L[6]，它可利用多種生物質(zhì)水解液，并對(duì)其中的抑制成分有較好的耐受性[7]，因此是一株具有良好工業(yè)應(yīng)用潛能的菌株。

圖1 比較圓紅冬孢酵母與釀酒酵母脂肪酸合酶Fig.1Comparison of the fatty acid synthases from R.toruloides and S.cerevisiae.The FASs are composed of the following domains,acetyl transferase,AT;enoyl reductase,ER;dehydratase,DH;malonyl/palmitoyl transferase,MPT; acyl carrier protein,ACP;ketoacyl reductase,KR;ketoacyl synthase,KS and phosphopantetheinyl transferase,PPT.

對(duì)圓紅冬孢酵母進(jìn)行了基因組測(cè)序和注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)它含新穎的脂肪酸合酶(FAS)基因[8]，該酶由兩個(gè)亞基組成，且與其他物種(如釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae)的FAS明顯不同(圖1)。其β亞基(Fas1)由乙酰轉(zhuǎn)移酶(Acetyl transferase)和烯酰還原酶(Enoyl reductase)結(jié)構(gòu)域組成，而α亞基(Fas2)由脫水酶(Dehydratase)、丙二酰/棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(Malonyl/palmitoyl transferase)、酰基載體蛋白(Acyl carrier protein，ACP)、酮酰還原酶(Ketoacyl reductase)、酮酰合酶(Ketoacyl synthase)和磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(Phosphopantetheinyl transferase，PPT)結(jié)構(gòu)域組成。且Fas2含兩個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域，它們的序列一致性達(dá)到76%。到目前為止，首次發(fā)現(xiàn)FAS含兩個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域[8]。ACP在脂肪酸合成過(guò)程中，起輔因子作用。被PPT活化后，在保守的絲氨酸殘基上修飾磷酸泛酰巰基乙胺，而磷酸泛酰巰基乙胺含巰基，可共價(jià)結(jié)合酰基基團(tuán)[9]，而酰基-ACP在FAS的不同活性位點(diǎn)處完成各步反應(yīng)，每個(gè)周期增加一個(gè)二碳單元(-CH2CH2-)[10-11]。釀酒酵母FAS為α6β6異十二聚體，分子量約為2 600 kDa，該巨型復(fù)合物形成6個(gè)反應(yīng)活性空腔[10-12]，每個(gè)空腔包含所有酶活性位點(diǎn)和一個(gè)輔因子ACP。若圓紅冬孢酵母FAS也形成類(lèi)似復(fù)合物結(jié)構(gòu)，其活性空腔將含兩個(gè)ACP，故可能提高空腔中反應(yīng)中間物濃度，有利于脂肪酸合成[13]。為研究圓紅冬孢酵母FAS的生物化學(xué)與結(jié)構(gòu)特性，構(gòu)建了表達(dá)FAS兩個(gè)亞基的載體，在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)了該復(fù)合物，經(jīng)硫酸銨沉淀、蔗糖密度梯度離心和陰離子交換層析純化，所得重組FAS的比活力超過(guò)500 mU/mg。

1 材料與方法

1.1 材料

pYX212-FAS1-FAS2-WT質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[14]；抗生素、β-巰基乙醇(β-ME)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、溶菌酶、HEPES、EDTA、E.coli DH5α和BL21(DE3)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；pET22b(+)、pET24b(+)和pACYCDuet-1載體購(gòu)自Novagen公司；PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；所用引物如表1所列，引物由鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司合成；DNA測(cè)序由北京Invitrogen公司完成；NADPH、乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A購(gòu)自Sigma公司；DEAE Sepharose Fast Flow樹(shù)脂購(gòu)自GE Healthcare公司；cOmplete蛋白酶抑制劑購(gòu)自Roche公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。LB培養(yǎng)基組成為10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L NaCl，pH 7.0；TB培養(yǎng)基組成為12 g/L蛋白胨，24 g/L酵母粉，4 mL/L甘油，0.017 mol/L KH2PO4和0.072 mol/L K2HPO4。

表1 質(zhì)粒構(gòu)建所用的引物序列Table 1Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 FAS表達(dá)載體的構(gòu)建

以pYX212-FAS1-FAS2-WT為模板，使用FAS1-5-NdeI/FAS1-3-EcoRI引物擴(kuò)增FAS1基因，該片段在5′端引入StrepⅡ-標(biāo)簽序列，獲得的片段經(jīng)NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切，連入同樣酶切的pET24b(+)載體，得到質(zhì)粒pET24b-FAS1。使用FAS1-5-NdeⅠ-His/FAS1-3-EcoRⅠ引物擴(kuò)增FAS1基因，該片段在5′端引入His-標(biāo)簽序列，并連入pET22b(+)載體的NdeⅠ/EcoRⅠ位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pET22b-His-FAS1。也將pET24b-FAS1上的NdeⅠ/EcoRⅠ插入片段連入pET22b(+)載體得到pET22b-FAS1。以pET24b-FAS1為模板，使用FAS1-5-NcoⅠ/FAS1-3-HindⅢ引物擴(kuò)增帶StrepII-標(biāo)簽的FAS1基因，經(jīng)NcoⅠ/HindⅢ雙酶切后連入表達(dá)載體pACYCDuet-1，得到質(zhì)粒pACYC-FAS1。

以pYX212-FAS1-FAS2-WT為模板，用FAS2-5-HindⅢ/FAS2-3-NotⅠ引物擴(kuò)增FAS2基因，得到的片段經(jīng)HindⅢ/NotⅠ雙酶切，連入同樣酶切的pET24b(+)載體，得到質(zhì)粒pET24b-FAS2，用于表達(dá)C端帶His-標(biāo)簽的融合蛋白。用FAS2-5-NdeⅠ/FAS2-3-His-AvrⅡ引物擴(kuò)增FAS2基因，該片段在3′端引入His-標(biāo)簽序列，經(jīng)NdeⅠ/AvrⅡ雙酶切后連入前面獲得的pACYC-FAS1質(zhì)粒，得到pACYC-FAS1-FAS2質(zhì)粒。前面所得正確質(zhì)粒，均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)堿基突變。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，得到重組菌株。構(gòu)建的質(zhì)粒和重組菌株如表2所示。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)純化

接種重組菌株ZWE06的單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL卡那霉素)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取1 mL接種于400 mL TB培養(yǎng)基(含100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL卡那霉素)，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h，離心收集菌體，–20℃保存。

以下純化步驟在冰上或4℃進(jìn)行。

細(xì)胞裂解：濕菌體約12 g，以1∶3比例加入裂解緩沖液(100 mmol/L K3PO4，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L β-ME，1 mmol/L PMSF，3 mmol/L MgCl2，0.5 mg/mL溶菌酶，蛋白酶抑制劑2片，pH 7.0)，超聲裂解細(xì)胞，18 000×g離心30 min，去細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移至錐形瓶，并加入磁轉(zhuǎn)子。

表2 構(gòu)建的質(zhì)粒和重組菌株Table 2Plasmids and strains used in this study

硫酸銨沉淀：上述細(xì)胞裂解上清液中，加入1/4體積的飽和硫酸銨溶液(pH 7.0)，使硫酸銨終濃度為20%，攪拌30 min，18 000×g離心30 min。上清液中加入1/3體積的飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨終濃度增加到40%，攪拌30 min，18 000×g離心30 min。沉淀溶于16 mL緩沖液A(20 mmol/L HEPES，100 mmol/L KCl，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L β-ME，pH 8.0)。

蔗糖密度梯度離心：用緩沖液A配制10%、 15%、20%、25%、30%、35%和40%(W/V)蔗糖溶液，使用38.5 mL的Ultra Clear Open-top離心管，依次加入5 mL上述蔗糖溶液，制成分階蔗糖梯度溶液，室溫放置7 h，讓其形成線性密度梯度。然后加入2.8 mL蛋白溶液，使用Beckman SW32轉(zhuǎn)頭，90 000×g、4℃離心15 h。從上往下依次用針頭抽取3 mL樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析，含F(xiàn)AS兩個(gè)亞基的組分被混合，超濾濃縮。

弱陰離子交換層析：層析填料DEAE Sepharose Fast Flow，層析柱直徑25 mm，裝填量約15 cm(約80 mL)。先使用400 mL緩沖液A平衡層析柱，超濾濃縮的蛋白樣品上樣，然后用100 mL緩沖液A洗滌，再用250 mL緩沖液A和250 mL緩沖液B(20 mmol/L HEPES，800 mmol/L KCl，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L β-ME，pH 8.0)組成的梯度混合液洗脫，自動(dòng)收集洗脫蛋白，洗脫組分用Bradford法測(cè)量蛋白濃度，SDS-PAGE分析，含目的蛋白的組分被合并，并超濾濃縮。

1.2.3 活性檢測(cè)

酶活測(cè)定反應(yīng)體系含100 mmol/L K3PO4(pH 7.0)，5 mmol/L EDTA，5 mmol/L DTT，12.5 μmol/L乙酰輔酶A，50 μmol/L丙二酸單酰輔酶A，75 μmol/L NADPH，加入適量酶，在200 μL的微型石英比色皿中，室溫(約25℃)反應(yīng)，檢測(cè)340 nm吸光值的變化，以不加丙二酸單酰輔酶A為對(duì)照。酶活單位定義，每分鐘消耗1 nmol NADPH(1 mL反應(yīng)體系中，吸光度減少0.006 2)所需酶量為1 mU。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAS表達(dá)菌株構(gòu)建與優(yōu)化

圓紅冬孢酵母FAS含有兩個(gè)亞基，分別由FAS1和FAS2基因編碼，F(xiàn)as1含1 266個(gè)氨基酸，F(xiàn)as2含2 928個(gè)氨基酸(GenBank Accession No.分別為EMS21161和EMS21268)，故這兩個(gè)亞基均為大蛋白。將FAS1和FAS2基因分別克隆到表達(dá)載體pET24b(+)，并轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)得到重組菌株ZWE01和ZWE02，IPTG可誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，且均為可溶性蛋白(圖2)。

為純化FAS復(fù)合物，需在同一菌株中表達(dá)兩個(gè)亞基，使表達(dá)產(chǎn)物形成復(fù)合物[15]。為此，將FAS1和FAS2克隆到可表達(dá)兩個(gè)蛋白的pACYCDuet-1載體，該載體含有兩個(gè)多克隆位點(diǎn)，且都置于表達(dá)元件(T7啟動(dòng)子/lac操縱子和核糖體結(jié)合位點(diǎn))下游。然而，含pACYCFAS1-FAS2質(zhì)粒的重組菌株ZWE04只大量表達(dá)

圖2SDS-PAGE分析重組菌株表達(dá)目的蛋白Fig.2SDS-PAGE analysis of the cell lysates from recombinant strains with the indicated plasmids.White and black arrows indicated expressed Fas1 and Fas2 subunits,respectively.The cells were precultured in LB broth with appropriate amount of antibiotics at 37℃to OD600～0.8,then 0.5 mmol/L IPTG was added and the temperature was reducedto 16℃to induce the expressionofrecombinantproteins,exceptingthe control culture without IPTG.Cell pellets harvested fromovernightculturewereusedforSDS-PAGE analysis.

Fas1蛋白，而更大的Fas2蛋白基本不表達(dá)(圖2)。

然后，在E.coli BL21(DE3)中同時(shí)轉(zhuǎn)化pACYC-FAS1和pET24b-FAS2質(zhì)粒，得到重組菌株ZWE05。這兩個(gè)質(zhì)粒含不同復(fù)制區(qū)和抗性標(biāo)記基因，具有很好的兼容性。雖然重組菌株ZWE05可同時(shí)表達(dá)兩個(gè)蛋白，但Fas1表達(dá)量明顯低于Fas2(圖2)，可能是由于pACYCDuet-1質(zhì)粒使用P15A復(fù)制子，而pET24b(+)使用pBR322復(fù)制區(qū)，前者質(zhì)粒拷貝數(shù)只有后者的1/4[16]，故導(dǎo)致Fas1表達(dá)水平偏低。

由于FAS兩個(gè)亞基的計(jì)量關(guān)系為1∶1，但重組菌株ZWE05，兩個(gè)亞基的表達(dá)水平不協(xié)調(diào)。pET22b(+)與pET24b(+)載體都使用pBR322復(fù)制區(qū)，但含不同抗性標(biāo)記基因，因此用兩種抗生素可維持這兩個(gè)并不兼容的質(zhì)粒復(fù)制，且質(zhì)?？截悢?shù)相近。用不兼容質(zhì)粒共表達(dá)目的蛋白已有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，因此，將pET22b-FAS1和pET24b-FAS2質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，得到的重組菌株ZWE06，可表達(dá)FAS的兩個(gè)亞基。SDS-PAGE分析表明，含pET22b-FAS1和pET24b-FAS2質(zhì)粒的重組菌株ZWE06，兩個(gè)蛋白的表達(dá)量相當(dāng)(圖3)。

2.2 純化重組的FAS

重組菌株ZWE06，表達(dá)N端帶StrepII-標(biāo)簽的Fas1和C端帶His-標(biāo)簽的Fas2，嘗試了Ni-NTA樹(shù)脂親和層析純化FAS復(fù)合物，但沒(méi)有成功。為此，又構(gòu)建了pET22b-His-FAS1質(zhì)粒用于表達(dá)N端帶His-標(biāo)簽的Fas1。含pET22b-His-FAS1和pET24b-FAS2質(zhì)粒的重組菌株ZWE07也可較好地表達(dá)兩個(gè)蛋白(結(jié)果未列出)，但使用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析純化FAS，仍然沒(méi)有成功。

圖3 比較兩重組菌株目的蛋白表達(dá)水平Fig.3Comparison of the expression of FAS subunits in the strains with plasmids as indicated.The arrows indicated expressed Fas1 and Fas2 subunits.The culture conditions were the same as Fig.2,and 5 or 10 μL cell lysates(as indicated)from the same volume of culture broth were loaded into the gel.M:protein molecular weight standard.

最后，使用重組菌株ZWE06表達(dá)FAS兩個(gè)亞基，經(jīng)硫酸銨沉淀富集目的蛋白，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明30%–40%飽和硫酸銨分級(jí)沉淀，回收目的蛋白最多，回收率達(dá)70%，最終選擇20%–40%飽和硫酸銨沉淀，目的蛋白回收率為92%。

由于釀酒酵母FAS為α6β6復(fù)合物，其分子量達(dá)2 600 kDa，推測(cè)圓紅冬孢酵母FAS也可能組裝成類(lèi)似的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，而具有相當(dāng)?shù)姆肿恿?。?duì)于該巨型復(fù)合物，可采用蔗糖密度梯度離心進(jìn)行分離。使用10%–40%線性蔗糖密度梯度，Beckman SW32轉(zhuǎn)頭，90 000×g離心15 h，兩個(gè)亞基蛋白同時(shí)出現(xiàn)在蔗糖密度超過(guò)25%的梯度層(圖4，泳道8)，該結(jié)果與釀酒酵母FAS的蔗糖密度梯度離心結(jié)果類(lèi)似[10]，表明圓紅冬孢酵母FAS可能具有與釀酒酵母FAS類(lèi)似的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。同時(shí)大量游離的Fas1亞基蛋白存在于低蔗糖密度層(圖4，泳道4，白色箭頭)，且許多FAS蛋白凝集體存在于離心沉淀中(圖4，泳道p，白色和黑色箭頭)，說(shuō)明蔗糖密度梯度離心不僅能分離雜蛋白，而且可以去除游離的亞基和蛋白凝集體。

圖4 SDS-PAGE分析蔗糖密度梯度離心分離組分Fig.4SDS-PAGE analysis of the protein fractions from sucrose density gradient centrifugation.From lane 1 to 12,the sucrose density increased from 10%to 40%. Lane p was loaded with proteins from the centrifugation pellets.White and black arrows indicated the Fas1 and Fas2 subunits,respectively.

收集含F(xiàn)AS復(fù)合物的蔗糖層，超濾濃縮后，經(jīng)陰離子交換層析進(jìn)一步純化，使用的填料為DEAE Sepharose弱陰離子交換樹(shù)脂，KCl濃度梯度洗脫，目的蛋白被100–200 mmol/L的KCl洗脫。經(jīng)過(guò)上述三步純化，F(xiàn)AS的純度達(dá)到90%以上(圖5)。再次用蔗糖密度梯度離心分析表明只有一條單一的蛋白區(qū)帶。

2.3 FAS的酶活性測(cè)定

圖5 SDS-PAGE分析純化過(guò)程的蛋白樣品Fig.5SDS-PAGE analysis of proteins obtained from the purification procedures.The arrows indicated Fas1 and Fas2 subunits.Equal amount of proteins(3 μg)were loaded in each lane.lane 1:lysate supernatant;lane 2: 20%–40%(NH4)2SO4precipitation;lane 3:sucrose density gradient centrifugation;lane 4:DEAE sepharose anion exchange chromatography;M:protein molecular weight standard.

由于FAS的底物NADPH在340 nm有特征吸收峰，比摩爾消光系數(shù)為6.2×103L/(mol·cm)，故可直接檢測(cè)底物NADPH消耗速率[18]。采用分光光度法進(jìn)行酶活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)重組圓紅冬孢酵母FAS的比活力為(548±16)mU/mg。

3 討論

圓紅冬孢酵母是一株性狀突出的產(chǎn)油酵母，為了解其油脂積累機(jī)制，進(jìn)行了基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一些可能與油脂過(guò)量積累相關(guān)的基因，其中包括FAS基因，編碼FAS兩個(gè)亞基的基因FAS1和FAS2，在油脂積累過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[8]。而檢查了兩個(gè)亞基的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它們具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域組成，并含有兩個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域(圖1)。到目前為止，只在紅酵母中發(fā)現(xiàn)了這種含多個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的FAS。然而與FAS類(lèi)似的由多結(jié)構(gòu)域組成的聚酮合酶(Polyketide synthases，PKS)，經(jīng)常含有多個(gè)ACP[19]。有研究證明，含5個(gè)串聯(lián)ACP的多不飽和脂肪酸合酶(屬于PKS，而非FAS)，活性ACP數(shù)量越多，其合成多不飽和脂肪酸的能力越強(qiáng)[20]。Curacin A合成途徑的CurA蛋白含有3個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域，類(lèi)似研究也證明ACP數(shù)量越多，Curacin A得率越高[21]。

脂肪酸合成是生物界通用的代謝反應(yīng)，然而不同物種的FAS卻有很大差別。在原核生物或植物質(zhì)體中，F(xiàn)AS由多個(gè)分開(kāi)的蛋白組成；而在真菌或動(dòng)物中，F(xiàn)AS是由不同結(jié)構(gòu)域組成的多酶體系[22]。圓紅冬孢酵母FAS為真菌型多結(jié)構(gòu)域蛋白，且該酵母只含一套FAS系統(tǒng)。ACP是脂肪酸合成必需的蛋白輔因子[23]，在E.coli中，ACP是高豐度蛋白(胞內(nèi)濃度約為100 mol/L)，而在真菌中，由于FAS復(fù)合物形成6個(gè)反應(yīng)空腔，有學(xué)者認(rèn)為在每個(gè)反應(yīng)空腔中，ACP的濃度比E.coli中高一個(gè)數(shù)量級(jí)，從而有效地提高了反應(yīng)中間物濃度，使催化效率更高[13]。圓紅冬孢酵母FAS含有兩個(gè)ACP，且蔗糖密度梯度離心結(jié)果表明它可能形成與釀酒酵母FAS類(lèi)似的巨型復(fù)合物，按照前面的假設(shè)，則活性中心ACP濃度更高，將可能具有更好的催化活性。本文建立了圓紅冬孢酵母FAS表達(dá)純化條件，為研究其酶動(dòng)力學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)該新穎的FAS可用于脂肪酸類(lèi)生物燃料的代謝工程和合成生物學(xué)研究[24-26]。 REFERENCES

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(本文責(zé)編郝麗芳)

Expression,purification and characterization of a novel fatty acid synthase from Rhodosporidium toruloides

Zhiwei Zhu1,3,Sufang Zhang1,2,Xinping Lin1,3,Wujun Liu1,2,and Zongbao K.Zhao1,2
1 Division of Biotechnology,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,Liaoning,China
2 Dalian National Laboratory for Clean Energy,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023, Liaoning,China
3 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China

Fatty acid synthase(FAS)catalyses the reaction between acetyl-CoA and malonyl-CoA to produce fatty acids. It is one of the most important enzyme in lipid biosynthesis.FAS of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides has two acyl carrier protein(ACP)domains and a distinct subunit composition compared with FASs of other species.As ACP is a protein cofactor crucial for fatty acid chain elongation,more ACPs in the FAS may facilitate the reaction.To study the biochemical and structural properties of this novel FAS from R.toruloides,plasmids were constructed and transformed into Escherichia coli BL21(DE3).The strain ZWE06 harboring plasmids pET22b-FAS1 and pET24b-FAS2 could co-overexpress the two subunits.The recombinant FAS was purified by sequentially using ammonium sulphate precipitation,sucrose density gradient centrifugation and anion exchange chromatography.The specific activity of the recombinant FAS was 548 mU/mg.The purified complex would be used to study enzyme kinetics and protein structure of FAS,and heterogeneous expression and purification will facilitate revealing the mechanism of this novel FAS with double ACPs.

Rhodosporidium toruloides,fatty acid synthase,overexpression,purification,enzyme activity

December 11,2013;Accepted:January 24,2014

Zongbao K.Zhao.Tel/Fax:+86-411-84379211;E-mail:zhaozb@dicp.ac.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.31000052,31170060).

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.31000052,31170060)資助。

時(shí)間：2014-03-10網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.130626.html