木質纖維素水解液副產物對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響

王風芹，劉亞瓊，張瑞，汪媛媛，謝慧，宋安東

河南農業(yè)大學生命科學學院 農業(yè)部農業(yè)微生物酶工程重點實驗室，河南 鄭州 450002

能源問題是當今世界面臨的關系國家安全和社會經濟可持續(xù)發(fā)展的焦點，纖維乙醇因其原料來源廣泛、清潔、可再生的特點被認為是21世紀發(fā)展循環(huán)經濟的有效途徑[1-2]。纖維乙醇同步糖化發(fā)酵 (Simultaneous saccharification and fermentation，SSF) 將木質纖維素水解與乙醇發(fā)酵同步進行，理論上可解除水解得到的葡萄糖等產物對纖維素酶的反饋抑制，提高酶解效率，縮短發(fā)酵周期，降低生產成本[3]。然而傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵菌株的最適發(fā)酵溫度在28?32 ℃之間，一般不超過35 ℃[4]，而木質纖維素的最適糖化溫度為 45?50 ℃，發(fā)酵溫度與糖化溫度不協(xié)調是限制 SSF順利進行的關鍵問題之一，耐高溫乙醇發(fā)酵菌株的選育是解決該問題的有效途徑。

木質纖維素資源主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，通過預處理技術可以使木質纖維素結構松散，將更多的纖維素和半纖維素暴露在表面，促進后期的水解糖化[5]。預處理后的木質纖維素經水解糖化后形成以葡萄糖和木糖為主的單糖水解液，高效利用葡萄糖等單糖是纖維質原料乙醇發(fā)酵的關鍵。但是葡萄糖等糖類物質以及木質素降解的多種單環(huán)芳香族化合物在高溫下會進一步發(fā)生多種形式的分解和氧化反應，產生有機酸 (甲酸、乙酸和少量的乙酰丙酸等)、醛類 (糠醛、羥甲基糠醛等) 和芳香族化合物等對微生物生長和代謝具有抑制作用的副產物，這些副產物通過抑制酵母菌的有氧呼吸、增加細胞膜的透性、破壞酶活性等抑制微生物菌體生長和產物生成[6-7]。

課題組從煙葉腐解物中分離篩選出一株東方伊薩酵母Issatchenkia orientalisHN-1菌株，該菌株具有發(fā)酵溫度高 (38?45 ℃)、耐高糖(150 g/L葡萄糖) 等特點，利用含43.08 g/L葡萄糖的玉米秸稈水解液發(fā)酵，乙醇產量達20.74 g/L，為理論轉化率的91.6%[8]。本文研究了木質纖維素水解液主要副產物甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛等對東方伊薩酵母菌體生長和乙醇生成的影響，以進一步客觀評判該菌株用于纖維乙醇發(fā)酵的潛力，并為提高東方伊薩酵母纖維水解液乙醇發(fā)酵的生產效率奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

東方伊薩酵母Issatchenkia orientalisHN-1，由河南農業(yè)大學微生物能源工程研究室分離保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌種活化培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L，115 ℃滅菌15 min。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖50 g，酵母粉3 g，蛋白胨5 g，尿素0.2 g，磷酸氫二銨0.1 g，蒸餾水定容至1 L，pH值5.5，115 ℃滅菌15 min。

1.3 試驗設計

1.3.1 抑制物對乙醇發(fā)酵單因素影響試驗設計

選取甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-羥甲基糠醛 (5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF) 和香草醛作為考察因素，其添加濃度分別為：甲酸鈉：0、1、2、3、5 g/L；乙酸鈉：0、2.5、4、6、8 g/L；糠醛：0、0.2、0.4、1、2 g/L；5-HMF：0、0.1、0.3、1 g/L；香草醛：0、0.5、0.75、1、2 g/L。

1.3.2 抑制物對乙醇發(fā)酵交互影響試驗設計

選取甲酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛4種抑制物為自變量考察因素，以發(fā)酵36 h時乙醇濃度為響應值，運用中心組合試驗設計 (The Central Composite experimental Design, CCD)，考察抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵的影響。中心組合試驗設計因素和水平如表1所示。

表1 中心組合試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of CCD test

1.4 菌種活化與擴大培養(yǎng)

取斜面保藏菌種接種至菌種活化固體斜面培養(yǎng)基，38 ℃培養(yǎng)48 h后，接3環(huán)斜面活化菌種至裝有50 mL液體活化培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，38 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)10 h。

1.5 發(fā)酵試驗

按照試驗設計在300 mL三角瓶中配制添加不同濃度抑制物的發(fā)酵培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min，按體積分數(shù)為10%接種量接入活化好的種子液，控制最終裝液量240 mL，38 ℃靜置發(fā)酵。

1.6 測定方法

取發(fā)酵液2 mL，9 000 r/min離心10 min，液體部分留樣測定乙醇和葡萄糖濃度，細胞沉淀用質量分數(shù)0.85% NaCl水洗2次后重懸浮，用分光光度計測定660 nm處吸光值，利用吸光值與菌體細胞干重標準曲線 (y=1.493 8x+0.009 8，R2=0.9 9 9 3) 換算細胞干質量。

乙醇濃度采用氣相色譜儀 (Agilent technologies 7890A GC System) 進行測定，色譜柱：DB-FFAP (30 m×0.32 mm×1 μm)；檢測器：FID (250 ℃)；進樣溫度：200 ℃；柱溫：60 ℃；氮氣：25 mL/min；氫氣：40 mL/min；空氣：45 mL/min。

葡萄糖濃度采用 P680高效液相色譜儀(Diodex) 進行測定， RI 101示差折光 (Shodex)檢測器；色譜柱：Xbridge Amide 3.5 (4.6 mm×250 mm，Waters)；流動相：V乙腈： V水=8∶2(V∶V)，流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃。

甲酸鈉和乙酸鈉濃度采用高效液相色譜儀(HPLC, Shimadzu, Kyoto, Japan) 進行測定，色譜柱：Rezex ROA-Organic Acid H+，紫外檢測器 (SPD-15C UV-210 nm)，柱溫45 ℃，流動相：0.005 mol/L H2SO4(pH 2)，流速：0.6 mL/min，進樣量：20 μL。

糠醛、5-羥甲基糠醛和香草醛濃度采用Waters 2695高效液相色譜儀，Waters Sunfire C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm)，Waters 2996二極管矩陣檢測器。流動相：A：1%乙酸，B：甲醇，梯度洗脫：0?15 min，72% A；15?35 min，53% A。流速：0.6 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：280 nm，進樣量：10 μL。

2 結果與分析

2.1 木質纖維素水解液副產物對乙醇發(fā)酵的單因素影響試驗

2.1.1 甲酸鈉和乙酸鈉對乙醇發(fā)酵的影響

甲酸鈉和乙酸鈉對東方伊薩酵母 HN-1菌株的菌體生長具有顯著抑制作用，添加1–5 g/L甲酸鈉或2.5?8.0 g/L乙酸鈉，發(fā)酵36 h時菌體細胞干重分別較對照下降了 25.04%?37.02%和28.83%?43.82% (圖1)。添加1 g/L甲酸鈉可以提高菌體對葡萄糖的利用速率和發(fā)酵前期(24 h前) 乙醇的生成速率，然而培養(yǎng)基中添加1?5 g/L甲酸鈉對乙醇的最終產量影響不大 (圖1A)。低于8 g/L乙酸鈉添加量對葡萄糖利用速率影響不明顯；4 g/L乙酸鈉添加能顯著促進發(fā)酵前期乙醇產生速率，當乙酸鈉添加量達到8 g/L時，乙醇產量提高10.23% (圖1B)。東方伊薩酵母不具有降解轉化甲酸鈉和乙酸鈉的能力。

2.1.2 糠醛和5-HMF對乙醇發(fā)酵的影響

糠醛和5-HMF是木質纖維素水解液中主要的醛類抑制物。由圖 2可以看出，糠醛主要抑制菌體的生長，培養(yǎng)基中添加0.4?2 g/L糠醛，發(fā)酵 36 h時菌體細胞干重較對照下降了20.06%?37.60%。培養(yǎng)基中添加0.2?2 g/L糠醛對乙醇產量和乙醇產生速率沒有顯著影響 (圖2A)。添加0.1?1 g/L 5-HMF對菌體生長影響不顯著。培養(yǎng)基中5-HMF濃度< 1 g/L時，對乙醇產量沒有顯著影響；添加1 g/L 5-HMF，乙醇產量較對照降低了11.2%，達到顯著水平 (圖2B)。在發(fā)酵12 h和24 h時，2 g/L糠醛和1 g/L 5-HMF可被東方伊薩酵母HN-1完全轉化利用。

2.1.3 香草醛對乙醇發(fā)酵的影響

香草醛可以顯著抑制微生物菌體的生長，添加0.5?2 g/L香草醛，發(fā)酵36 h時菌體細胞干重較對照下降了26.39%?52.64%。與對照相比，添加2 g/L香草醛，乙醇產生速率和乙醇產量均顯著降低，發(fā)酵 36 h時乙醇產量較對照降低20.38% (圖 3)。

圖1 甲酸鈉 (A) 和乙酸鈉 (B) 對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig. 1 The influence of sodium formate (A) and sodium acetic (B) on ethanol fermentation of Issatchenkia orientalis HN-1.

圖2 糠醛 (A) 和5-HMF (B) 對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig. 2 The influence of furfural (A) and 5-HMF (B) on ethanol fermentation of Issatchenkia orientalis HN-1.

圖3 香草醛對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig. 3 The influence of Vanillin on ethanol fermentation of Issatchenkia orientalis HN-1.

2.2 抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵的影響

根據(jù)單因素試驗結果及已有的文獻報道，選取甲酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛4個因素，運用響應面中心組合試驗設計研究抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵的影響。根據(jù)設計結果，共安排30組試驗，發(fā)酵36 h的乙醇產量結果見表2，其方差分析結果如表3所示。甲酸、糠醛、5-HMF和香草醛 4種抑制物交互作用對乙醇發(fā)酵影響不顯著，但香草醛對乙醇產量影響的P值為0.038 9，達到顯著水平。

3 討論

木質纖維素預處理過程中產生的有機酸、醛類和芳香族化合物等副產物對微生物生長和代謝的抑制作用是影響木質纖維素原料乙醇轉化過程的重要因素之一。其中有機酸分子如甲酸、乙酸、乙酰丙酸等通過簡單擴散進入細胞內并發(fā)生解離，使細胞膜內H+濃度增加，通過破壞膜電位使ATP不能正常生成，最終引起細胞生長代謝緩慢或死亡[9]；纖維水解液中以糠醛和 5-HMF為主的醛類物質能在一定程度上增加細胞膜的通透性，破壞酶活性，直接或間接影響糖代謝途徑[10-11]；香草醛、丁香醛等酚類物質是木質素的主要降解物，這類物質能夠破壞細胞膜的完整性，影響膜的選擇透過性，從而影響菌體生長，其中，低分子量的香草醛負作用更明顯，1 g/L香草醛即開始抑制菌體生長[12]。

表2 中心組合試驗設計方案和發(fā)酵36 h時乙醇產量試驗結果Table 2 Design of CCD test and results of ethanol production fermented at 36 h

表3 CCD結果方差分析表Table 3 Uviariate analysis of variance of CCD test

覃香香等研究發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母S-7對半纖維素水解液中的微生物代謝抑制物乙酸、糠醛、香草醛、阿魏酸等具有較強的生物降解能力，可用于半纖維素水解液發(fā)酵生產木糖醇的生物脫毒[13]。本文研究了從煙葉腐解物中分離篩選出的耐高溫東方伊薩酵母 HN-1菌株對木質纖維素水解液副產物甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-羥甲基糠醛和香草醛的耐受能力，結果表明，木質纖維素水解液中含有的有毒物質對東方伊薩酵母菌體生長具有顯著抑制作用，添加1?5 g/L甲酸鈉、2.5?8.0g/L乙酸鈉、0.2?2 g/L糠醛或0.5?2 g/L香草醛，發(fā)酵36 h時菌體細胞干重分別較對照下降了25.04%?37.02%、28.83%?43.82%、20.06%?37.60%和 26.39%?52.64%。試驗濃度范圍內，甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛和5-HMF對乙醇發(fā)酵影響較小，但添加2 g/L香草醛或1 g/L 5-HMF可使乙醇產量分別降低20.38%和11.2% (圖2和3)。中心組合試驗結果表明，各抑制物對乙醇發(fā)酵影響的交互作用不顯著。表 4總結了木質纖維素水解液有毒物質對東方伊薩酵母 HN-1及其他微生物乙醇發(fā)酵影響的起始濃度。由表 4可以看出，東方伊薩酵母HN-1對甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF和香草醛的耐受能力與釀酒酵母相當，對糠醛、5-HMF和香草醛的耐受能力高于I. orientalisIPE 100。

表 5總結了近年來文獻報道的木質纖維素酶水解液中各有毒副產物的含量，除采用酸熱預處理得到的水解液中5-HMF含量及Alriksson利用蒸汽爆破和補料酶解得到的高糖水解液中甲酸和乙酸的含量較高外，其他水解液中5種有毒物質的含量均低于對東方伊薩酵母乙醇發(fā)酵產生抑制作用的起始濃度。本課題組建立了玉米秸稈的稀酸預處理和酶水解技術體系，采用補料酶解得到的水解液中葡萄糖和木糖的濃度分別為43.08和27.13 g/L，東方伊薩酵母HN-1利用該水解液發(fā)酵乙醇產量為20.74 g/L，乙醇產率為0.468 g/g，達到理論轉化率的91.6%[8]。該水解液中甲酸、乙酸、糠醛、5-HMF和香草醛的含量分別為：550、1 940、72.89、18、1.78 mg/L(表5)，水解液濃縮3倍后，各抑制物濃度將達到1 650、5 820、219、54和5.34 g/L，仍低于對東方伊薩酵母 HN-1乙醇發(fā)酵產生抑制的起始濃度。以上研究結果表明東方伊薩酵母具有較強的耐毒能力，可適用于木質纖維素水解液乙醇發(fā)酵。

表4 木質纖維素水解液有毒副產物影響乙醇發(fā)酵的起始抑制濃度Table 4 The initial inhibiting concentration of inhibitory compounds in lignocellulosic hydrolysate on ethanol production

表5 木質纖維素酶水解液中各有毒抑制物含量Table 5 The content of inhibitory compounds in lignocellulosic enzyme hydrlysates

4 結論

東方伊薩酵母 HN-1對木質纖維素水解液有毒副產物甲酸鈉、乙酸鈉、糠醛、5-HMF和香草醛具有較強的耐受能力，除添加2 g/L香草醛或添加1 g/L 5-HMF可使乙醇產量分別降低

20.38%和11.2%外，其他抑制物的添加對乙醇的生成未有顯著影響。但是，當副產物濃度較高時，可以顯著抑制菌體生長。中心組合試驗結果表明各抑制物交互作用對乙醇的生成影響不顯著。

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