吡格列酮對胰島素抵抗OLETF大鼠血清IL-18、TLR4表達的影響

孫立亭 趙志強 田鳳石

吡格列酮對胰島素抵抗OLETF大鼠血清IL-18、TLR4表達的影響

孫立亭1趙志強2田鳳石3△

目的 研究吡格列酮對胰島素抵抗(IR)自發(fā)性持續(xù)高血糖（OLETF）大鼠血清白細胞介素（IL）-18和Toll樣受體4（TLR4）表達的影響及其降低心血管疾病風險的可能機制。方法OLETF大鼠24只，高脂喂養(yǎng)20周建立IR模型，后隨機均分為模型（M）組和吡格列酮(P)組，M組繼續(xù)給予高脂飼料，P組給予吡格列酮加高脂飼料。另擇LETO大鼠12只為正常對照(NC)組，給予標準飼料。藥物干預20周后測定各組大鼠血清胰島素（FINS）、空腹血糖（FBG）、IR指數(shù)（HOMA-IR）、胰島素敏感指數(shù)（ISI）、三酰甘油(TG)、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、IL-18、TLR4水平。結果24只OLETF大鼠均造模成功。M組FBG、FINS、HOMAIR、TC、TG、LDL-C、IL-18和TLR4均高于NC組和P組，ISI、HDL-C均低于NC組和P組（均P＜0.05）。血清IL-18與FBG、FINS、HOMA-IR、TLR4呈正相關，與ISI呈負相關。血清TLR4與FBG、FINS、HOMA-IR、IL-18呈正相關，與ISI呈負相關（均P＜0.05）。多元Logistic回歸分析結果顯示IL-18、TLR4是HOMA-IR的影響因素。結論吡格列酮可改善OLETF大鼠的IR及炎癥狀態(tài)，其可能通過降低IL-18水平和抑制TLR4途徑發(fā)揮抗炎作用，從而降低心血管疾病的發(fā)生風險。

胰島素抵抗；白細胞介素18；Toll樣受體4；心血管疾??；大鼠,近交OLETF；吡格列酮

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）激動 劑羅格列酮在改善胰島素抵抗（IR）及降低血糖等方面的療效確切，但有研究表明羅格列酮可能無助于降低糖尿病患者心血管疾病的風險，反而會增加心肌梗死、心衰等心血管事件的發(fā)生率[1-2]。而Ciudin等[3]研究顯示，同為PPAR-γ激動劑的吡格列酮可使高風險患者的心血管事件的發(fā)生率降低19%，羅格列酮可使缺血性心血管事件增加1.8倍，心肌梗死的風險增加43%[4]。本研究通過建立自發(fā)性持續(xù)高血糖（otsuka long-evans tokushima fatty，OLETF）大鼠IR模型，并用吡格列酮進行干預，進一步探討吡格列酮改善IR、降低心血管疾病風險的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物。4周齡SPF級雄性OLETF大鼠24只，同品系long-evans tokushima fatty(LETO)大鼠12只，體質(zhì)量140～190 g，均購自日本大冢制藥公司研究所。（2）飼料。大鼠高脂飼料、標準飼料均購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所。（3）主要儀器與試劑。大鼠白細胞介素（IL）-18、Toll樣受體4（Toll like receptor 4,TLR4）ELISA試劑購自武漢華美生物技術有限公司，批號分別為CSB-EO4610r、CSB-E15822r；全自動生化分析儀（德國SWA公司）。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)與分組 參照文獻[5]建立IR模型。24只OLETF大鼠（高脂組）以高脂飼料喂養(yǎng)20周后，采用隨機數(shù)字表法分為2組：模型（M）組12只，繼續(xù)給予高脂飼料；吡格列酮（P）組12只，給予高脂飼料加吡格列酮2mg/（kg·d），干預20周。另12只LETO大鼠為正常對照（NC）組，以標準飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 指標檢測 高脂飼料喂養(yǎng)20周后，禁食12 h，采用葡萄糖酶法測定空腹血糖（FBG），放射免疫法測定血清胰島素（FINS），并計算IR指數(shù)[HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5]及胰島素敏感指數(shù)[ISI=Ln1(FBG×FINS)]，判斷是否成功建立IR模型。藥物干預20周后，禁食12 h，再次測定FBG、FINS、HOMA-IR和ISI。并取空腹股動脈血5 mL，離心分裝后于-20℃儲存?zhèn)溆?。采用全自動生化分析儀測定三酰甘油(TG)、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。采用雙抗體夾心ELISA法測定IL-18、TLR4，嚴格按照說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），進一步組間多重比較采用LSD-t檢驗；相關分析采用Pearson相關；HOMA-IR的影響因素采用多元Logistic回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OLETF大鼠IR模型的建立 高脂喂養(yǎng)20周后，高脂組FBG、FINS和HOMA-IR均明顯高于NC組，ISI低于NC組（均P＜0.01），見表1，表明成功建立IR模型[6]。

2.2 各組FBG、FINS、HOMA-IR、ISI的比較 干預后M組FBG、FINS和HOMA-IR均明顯高于NC組和P組，ISI均低于NC組和P組（均P＜0.05），見表2。

Table 1 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between NC group and high-fat diet feeding group表1NC組與高脂組FBG、FINS、HOMA-IR及ISI比較 （±s）

Table 1 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between NC group and high-fat diet feeding group表1NC組與高脂組FBG、FINS、HOMA-IR及ISI比較 （±s）

＊＊P＜0.01

組別NC組高脂組t n 12 24 FBG (mmol/L) 5.46±0.41 6.67±0.54 10.198＊＊FINS (mmol/L) 15.61±0.41 20.36±1.56 11.798＊＊HOMA-IR 3.79±0.35 6.24±0.48 15.499＊＊ISI -4.44±0.09 -4.94±0.07 17.133＊＊

Table 2 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between every group表2各組間FBG、FINS、HOMA-IR及ISI的比較（±s）

Table 2 Comparison of levels of FBG,FINS,HOMA-IR and ISI between every group表2各組間FBG、FINS、HOMA-IR及ISI的比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與M組比較，P＜0.05

組別NC組M組P組F n 12 12 12 FBG (mmol/L) 5.75±0.29a13.67±2.14 10.40±1.26a55.406＊＊FINS (mmol/L) 15.51±0.53a24.53±4.49 20.54±1.14a16.745＊＊HOMA-IR 3.96±0.21a14.87±3.31 9.50±1.29a46.129＊＊ISI -4.46±0.08a-6.03±0.08 -5.38±0.15a12.714＊＊

2.3 各組血脂水平的比較 干預后M組TC、TG和LDL-C均明顯高于NC組和P組，HDL-C均低于NC組和P組（均P＜0.05），見表3。

Table 3 Comparison of levels of TC,TG,HDL-C,LDLC between every group表3各組間TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比較（±s）

Table 3 Comparison of levels of TC,TG,HDL-C,LDLC between every group表3各組間TC、TG、HDL-C、LDL-C水平的比較（±s）

＊＊P＜0.01；a與M組比較，P＜0.05

組別NC組M組P組F n 12 12 12 TC (mmol/L) 2.61±0.14a3.50±0.18 2.65±0.29a32.619＊＊TG (mmol/L) 1.35±0.13a1.65±0.10 1.44±0.69a10.554＊＊HDL-C (mmol/L) 2.38±0.13a2.05±0.12 2.26±0.07a8.510＊＊LDL-C (mmol/L) 0.82±0.12a1.68±0.15 0.96±0.11a49.853＊＊

2.4 各組血清IL-18、TLR4水平的比較 干預后，M組IL-18、TLR4均高于NC組和P組（均P＜0.05），見表4。

2.5 IL-18、TLR4與其他指標的相關性分析 血清IL-18與FBG、FINS、HOMA-IR、TLR4呈正相關，與ISI呈負相關。血清TLR4與FBG、FINS、HOMA-IR呈正相關，與ISI呈負相關（均P＜0.05），見表5。

2.6 多因素Logistic回歸分析 以HOMA-IR為因變量，以FBG、FINS、TG、TC、HDL-C、LDL-C、IL-18、TLR4為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示IL-18、TLR4是HOMA-IR的影響因素，見表6。

Table 4 Comparison of levels of serum IL-18, TLR4between every group表4 各組間血清IL-18、TLR4水平的比較（±s）

Table 4 Comparison of levels of serum IL-18, TLR4between every group表4 各組間血清IL-18、TLR4水平的比較（±s）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與M組比較，P＜0.05

組別NC組M組P組F n 12 12 12 IL-18 (ng/L) 0.28±0.007a0.31±0.034 0.29±0.014a4.688＊TLR4 (ng/L) 2.12±0.39a7.02±4.43 2.53±1.35a19.615＊＊

Table 5 Correlation analysis between IL-18,TLR4 and other indicators表5 IL-18、TLR4與其他指標的Pearson相關性分析（r）

Table 6 The multinomal Logistic regression of influential factors of HOMA-IR表6 HOMA-IR影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

吡格列酮作為新一代的PPAR-γ激動劑，其保護血管內(nèi)皮功能、抗心肌缺血再灌注損傷等作用正日益受到關注。王浩等[7]研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可通過減少核因子(NF)-κB激活而上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子（TGF)β1的表達，從而發(fā)揮抗心肌細胞凋亡的作用。吳艷霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮素-1（ET-1）和TNF-α而發(fā)揮氧化應激和抗炎的作用，減少心肌梗死面積，改善左室功能。朱亭等[9]研究還發(fā)現(xiàn)，吡格列酮能降低肥胖伴T2DM患者炎癥因子C反應蛋白（CRP）、IL-6、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的水平，具有顯著的抗炎作用。

IL-18是繼TNF-α、IL-6之后發(fā)現(xiàn)的又一作用強大的前炎性細胞因子，在炎癥級聯(lián)反應中居中心地位，它能刺激TNF-α和IL-6的合成，參與IR、動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展。李巧汶等[10]研究還發(fā)現(xiàn)IL-18可能通過誘導斑塊內(nèi)細胞凋亡而促進易損斑塊的形成，導致急性冠脈綜合征的發(fā)生。本研究結果顯示，吡格列酮干預20周后，P組IL-18明顯低于M組，提示吡格列酮可能通過降低OLETF大鼠血清IL-18的水平而發(fā)揮抗動脈硬化、穩(wěn)定斑塊的作用。

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個TLR相關蛋白，TLR4介導的NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路能促進大量炎性因子TNF-α、IL-1等的產(chǎn)生，在心血管疾病的發(fā)展過程中起著十分重要的作用。Eissler等[11]研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠TLR4的表達較對照組明顯增強，提示TLR4介導的炎性反應可能參與了高血壓的發(fā)生。康曉敏等[12]對血管緊張素Ⅱ所致高血壓小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，注射TLR4中和抗體后，小鼠血壓下降，ET-1表達明顯下調(diào)，表明注射TLR4中和抗體可以抑制血管緊張素Ⅱ所致的高血壓小鼠血管內(nèi)皮收縮功能的損害，下調(diào)血管平滑肌增殖細胞核抗原（PCNA）的表達，這為TLR4參與血管緊張素所致的高血壓小鼠血管重構提供了直接的證據(jù)。Kashiwagi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在急性心肌梗死的患者中，TLR4的表達水平明顯升高，Riad等[14]對小鼠心肌梗死后6 d進行相關指標檢測，發(fā)現(xiàn)TLR4基因敲除小鼠的心功能較普通小鼠高，而心肌重構程度、心房利鈉肽、心肌總膠原蛋白的量以及心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值均低于對照小鼠，這說明TLR4對心肌梗死后心肌重構起促進作用。

本研究通過建立IR大鼠模型，用吡格列酮干預后發(fā)現(xiàn)，P組血清TLR4的水平明顯降低，提示吡格列酮可能通過降低TLR4的表達，抑制其所介導的炎性通路，從而起到改善IR及動脈粥樣硬化、穩(wěn)定動脈硬化斑塊的作用，而且還可減輕炎性反應所造成的心肌纖維化及心肌重構。隨著對TLR4研究的逐漸深入，TLR4所介導的免疫炎癥途徑可能成為心血管疾病新的干預治療靶點。吡格列酮通過抑制TLR4途徑及降低IL-18水平所發(fā)揮的抗炎作用，提示對于MS或糖尿病的患者，在常規(guī)治療的基礎上加用吡格列酮，可能會顯著降低其發(fā)生心血管疾病的風險。

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（2014-02-01收稿 2014-03-04修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Effect of Pioglitazone on Interleukin-18 and Toll-Like Receptor 4 Expression in OLETF Rats with Insulin Resistance

SUN Liting1,ZHAO Zhiqiang2,TIAN Fengshi3
1 Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2 Second Hospital of Tianjin Medical University; 3 The Fourth Center Hospital of Tianjin

Objective To investigate change of TLR4 in OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty)rats with insulin resistance(IR),and to study the effect of pioglitazone(PIO)on the expression of TLR4,and to explore the possible mechanisms of the PIO reducing the risk of cardiovascular diseases.MethodsTwenty four OLETF rats were fed with highfat diet for 20 weeks to establish the IR model then they were randomly assigned into two groups:the model group(group M), in which the rats were fed with high-fat diet;the PIO group(group P),in which the rats were fed with PIO in addition to highfat diet.Control group include 12 OLETF rats fed with normal diet(group NC).After 20 weeks of drug intervention,plasma levels of FINS(Fasting INSulin),FBG(Fasting Blood Glucose),blood lipid,IL-18 and TLR4 were assessed in every group.ResultsComparing with group NC,FBG,Blood lipid,IL-18 and TLR4 were significantly increased in group M（P＜0.05 or P＜0.01）,comparing with group M,FBG,Blood lipid were improved in group P,and serum IL-18,TLR4 were significantly lower in the group P than that in group M（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionTLR4 may be involved in IR by promoting inflammatory response,and PIO can significantly improve IR and inflammatory,and reduce the risk of cardiovascular diseases by inhibiting the expression of TLR4.

insulin resistance;interleukin-18;toll-like receptor 4;cardiovascular diseases;rats,inbred OLETF;pioglitazone

R587.1,R54

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.016

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院；3天津市第四中心醫(yī)院

△通訊作者 E-mail:fengshitian0801@hotmail.com