直腸癌HIF-1α和COX-2的表達與新輔助放化療敏感性的相關(guān)性

徐昶，宋華羽，左志貴，厲金雷，蔡劍輝，吳祥斌

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肛腸外科，浙江 溫州 325015）

近年來，術(shù)前新輔助放化療在中低位直腸癌治療中的價值已經(jīng)得到公認(rèn)，但是約有30%的患者對放化療不敏感，因此，尋找預(yù)測放化療敏感性的指標(biāo)成為研究的新熱點。近期研究認(rèn)為腫瘤低氧不僅與腫瘤的侵襲表型相關(guān)，還可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對放射線敏感性降低，并促進多藥耐藥基因表達，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生放化療抵抗[1-2]。低氧誘導(dǎo)因子1-α（hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）是唯一的特異性低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是HIF-1α的下游調(diào)控基因。本研究探討直腸癌中HIF-1α及COX-2的表達水平對新輔助放化療敏感性的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集本院2008年4月至2013年3月局部進展期直腸癌患者行新輔助放化療前的活檢標(biāo)本45例，男31例，女14例，年齡41～69歲，平均（59.9±7.8）歲。腫瘤下緣距離肛門2～8 cm。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）/國際抗癌聯(lián)盟（UICC）結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)（第七版）進行臨床T和N分期，采用3.0T MRI進行評估。TNM II期22例，TNM III期23例。T3 34例，T4 11例?；颊呔邮苄g(shù)前新輔助放化療并簽署知情同意書。本研究得到本院倫理委員會同意。

1.2 治療方法 新輔助放化療方案為卡培他濱825 mg/m2，每天2次，連續(xù)服用2周休息1周，共2個療程。放射治療采用標(biāo)準(zhǔn)的盆腔野照射，Dt 50 Gy/25次，照射野包括腫瘤原發(fā)灶和區(qū)域淋巴結(jié)。放療結(jié)束后第6周接受手術(shù)治療。

1.3 試劑和檢測方法 一抗HIF-1α和COX-2均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔二抗、DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。已知的HIF-1α、COX-2陽性的乳腺癌組織切片為陽性對照。以PBS代替一抗作為陰性對照。切片脫蠟去水，0.1%枸櫞酸修復(fù)抗原，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、封片。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 HIF-1α按照Birner等[3]采用的方法，以腫瘤細(xì)胞胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，綜合染色強度和陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比進行半定量處理。染色強度的評分標(biāo)準(zhǔn)：1分：弱染色但強于陰性對照；2分：中度染色；3分：強染色。陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比的評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：＜l%；1分：l%～lO%；2分：11%～50%；3分：51%～80%；4分：＞81%。上述評分結(jié)果兩項相加，1～3分為低表達；4～7分為高表達。COX-2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同上。同時量化HIF-1α和COX-2的表達水平：選擇相同的參數(shù)，每個標(biāo)本于癌巢隨機選取5個不重復(fù)的視野拍照。利用Imagepro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)檢測每張照片中腫瘤細(xì)胞的光密度值，取平均光密度（mean optical density，MOD）作為該例標(biāo)本的表達水平。

1.5 新輔助放化療效果評估方法 判斷T分期降期：依據(jù)術(shù)前影像學(xué)臨床分期，對比病理檢查后的T分期，判斷是否發(fā)生了T分期的改變。手術(shù)標(biāo)本由2位病理科醫(yī)師檢查閱片。腫瘤消退反應(yīng)的評判標(biāo)準(zhǔn)參照改良Wheeler直腸癌消退分級（modified rectal cancer regression grade，mRCRG）[4]進行評定：mRCRG I級：肉眼見病理特征改變，鏡下未見腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞癌巢少于5%，可以有黏液池存在，但是不含有腫瘤細(xì)胞；mRCRG II級：肉眼見病理特征改變，鏡下見腫瘤細(xì)胞與纖維組織混合，腫瘤細(xì)胞占5%～50%；mRCRG III級：肉眼及鏡下未見明顯放療后病理特征改變，腫瘤細(xì)胞超過50%，僅有一些類似于普通結(jié)締組織增生的纖維化組織。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用卡方檢驗及連續(xù)校正卡方檢驗分析HIF-1α和COX-2表達與直腸癌臨床特征及新輔助放化療效果的關(guān)系；采用Spearman等級相關(guān)分析HIF-1α與COX-2表達的相關(guān)性。P＜0．O5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療結(jié)果 45例患者全部完成術(shù)前新輔助放化療。21例患者出現(xiàn)局部放射性皮炎、惡心、嘔吐、骨髓抑制等不良反應(yīng)，經(jīng)對癥治療好轉(zhuǎn)。36例接受保肛術(shù)，9例接受經(jīng)腹會陰聯(lián)合切除術(shù)。新輔助放化療后的手術(shù)標(biāo)本鏡下可見腫瘤細(xì)胞纖維化（見圖1）。腫瘤細(xì)胞消退達到mRCRG I級14例（占31.1%），mRCRG II級22例（占48.9%），mRCRG III級9例（占20.0%）。術(shù)后T分期降期22例（占48.9%），T分期未降期23例（占51.1%），其中3例（占6.7%）出現(xiàn)T分期進展，由T3進展至T4。隨訪時間9～68個月，平均（28.5±13.5）月，無失訪病例，無局部復(fù)發(fā)病例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移7例，分別為4例肝轉(zhuǎn)移，2例腹膜后淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，1例肺轉(zhuǎn)移。

2.2 HIF-1α和COX-2表達與直腸癌臨床特征的關(guān)系 在新輔助放化療前直腸癌活檢組織標(biāo)本中HIF-1α表達率為73.3%，表達在腫瘤細(xì)胞核和細(xì)胞漿（見圖2）；COX-2表達率為82.2%，主要表達在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿（見圖3）。新輔助放化療前直腸癌活檢標(biāo)本中COX-2高表達組腫瘤直徑≥5 cm的患者占70.8%，高于低表達組（為28.6%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。性別、年齡、臨床T分期、是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與HIF-1α及COX-2的表達量均無關(guān)（P＞0.05）（見表1）。

2.3 HIF-1α和COX-2表達與直腸癌新輔助放化療效果的關(guān)系 新輔助放化療前直腸癌活檢組織中HIF-1α低表達組有50.0%患者在放化療后腫瘤消退達到mRCRG I級，而高表達組僅有16.0%達到mRCRG I級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HIF-1α低表達組在放化療后T分期降期率為70.0%，高表達組為32.0%，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。COX-2表達水平與mRCRG腫瘤消退等級及T分期降期無關(guān)（均P＞0.05）（見表1）。

圖1 新輔助放化療后少許殘留的癌細(xì)胞伴纖維組織增生（HE，×200）

圖2 HIF-1α在直腸癌組織中的表達（SP法，×400）

圖3 COX-2在直腸癌組織中的表達（SP法，×400）

表1 HIF-1α和COX-2表達與直腸癌臨床特征及新輔助放化療療效的關(guān)系

2.4 直腸癌組織中HIF-1α與COX-2表達的相關(guān)性采用光密度值量化新輔助放化療前直腸癌組織中HIF-1α和COX-2的表達水平，Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示兩者表達呈低度正相關(guān)（r=0.36，P=0.015）。

3 討論

低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下激活的主要轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1α是HIF-l的功能亞基，其調(diào)控的下游基因所編碼的蛋白功能中，最主要的是對腫瘤血管生成和能量代謝的調(diào)控，并通過促進腫瘤血管生成降低放射敏感性[1]。Kaidi等[5]報道了在低氧的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，HIF-1直接與COX-2啟動子中位于-506位點的低氧誘導(dǎo)應(yīng)答元件相結(jié)合，促進COX-2的表達，使PGE合成增加。低氧條件下HIF-1與COX-2/PGE2之間存在正反饋環(huán)路，COX-2/PGE2上調(diào)一旦觸動會不斷放大HIF-1作用，調(diào)節(jié)其他HIF-1的靶向基因，同時維持COX-2的高水平，促進腫瘤細(xì)胞對低氧的適應(yīng)，從而促進腫瘤的生存和轉(zhuǎn)移。

研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在一系列人類腫瘤中呈高表達，其表達水平隨著微環(huán)境氧濃度的改變而改變，與頭頸部癌、宮頸癌、前列腺癌、胃癌等腫瘤轉(zhuǎn)移能力、對放化療的抵抗直接相關(guān)[1，6]。目前對HIF-1α與直腸癌新輔助放化療關(guān)系的研究較少。已經(jīng)發(fā)表的文獻[7]認(rèn)為放療前HIF-1α表達水平與放療后腫瘤退縮程度無關(guān)，這與HIF-1α在其他腫瘤放化療中的研究結(jié)果相悖。原因可能在于作者采用的放療后腫瘤退縮評判標(biāo)準(zhǔn)并不適用于評價直腸癌新輔助放化療的效果。在評估直腸癌放化療療效的研究中，部分學(xué)者提出了“近完全緩解”的概念，認(rèn)為完全緩解和近完全緩解可以獲得很好的預(yù)后，無病生存率和總生存率都得到提高，這對直腸腫瘤預(yù)后的預(yù)測和治療更有指導(dǎo)意義[8-9]。我們采用改良Wheeler體系（mRCRG），以是否達到腫瘤細(xì)胞消退95%以上為標(biāo)準(zhǔn)來評判新輔助放化療的反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α的表達高低與放化療后腫瘤細(xì)胞消退程度密切相關(guān)，同時HIF-1α的表達水平與腫瘤T分期降期亦密切相關(guān)。HIF-1α高表達組新輔助放化療反應(yīng)性差，而低表達組可以獲得較好的新輔助放化療反應(yīng)。原因可能在于HIF-1α調(diào)控某些參與DNA修復(fù)過程的因子表達，放療時使電離輻射對腫瘤細(xì)胞DNA的損傷無法固定，并通過促進無氧代謝使殘留的腫瘤細(xì)胞獲得必要的生存條件。HIF-1α通過抗凋亡、上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），促進腫瘤血管生成而降低放射敏感性[1，10]。

盡管臨床前期研究顯示選擇性COX-2抑制劑能顯著增強腫瘤對放療的反應(yīng)性[11]，而且體內(nèi)外試驗也都支持這種觀點，但是來自人體直腸癌治療的研究數(shù)據(jù)仍然較少。我們的研究結(jié)果顯示COX-2的表達水平與腫瘤消退程度或T分期降期均無關(guān)，這與Bouzourene等[12]的研究結(jié)果相一致，他們發(fā)現(xiàn)COX-2的表達與腫瘤的炎癥反應(yīng)相關(guān)，而與放療敏感性并無相關(guān)。Kim等[13]也對包括COX-2和survivin在內(nèi)的7個分子標(biāo)志物做了直腸癌新輔助放化療敏感性預(yù)測分析，僅有survivin的高表達與腫瘤降期相關(guān)，而包括COX-2在內(nèi)的其他指標(biāo)都與降期無關(guān)。此外，我們的研究結(jié)果也顯示HIF-1α和COX-2在直腸癌組織中的表達水平只呈現(xiàn)低度正相關(guān)，這或許從另一方面提示在低氧的腫瘤中COX-2雖然是HIF-1α的下游調(diào)控基因，但是COX-2與HIF-1α可能通過多個未知的靶點在腫瘤中相互調(diào)節(jié)，COX-2在直腸癌放化療的敏感性中扮演更加復(fù)雜的角色，需要進一步的研究來深入闡明HIF-1α和COX-2互相作用的內(nèi)在機制。

綜上所述，新輔助治療前直腸癌組織HIF-1α的表達水平可能成為預(yù)測放化療后腫瘤退縮和T分期降期的敏感性指標(biāo)。影響直腸癌新輔助放化療療效的因素是多方面的，每個因素的變動都有可能對敏感性預(yù)測因子的判斷產(chǎn)生影響。選用對臨床具有指導(dǎo)意義的判斷標(biāo)準(zhǔn)，通過嚴(yán)格的臨床試驗設(shè)計，才能最終找到敏感性和特異性好的預(yù)測因子。

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