Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因在喉癌及喉角化癥組織中的表達(dá)及臨床意義

李萬(wàn)舉 孫敬武 別遠(yuǎn)志

喉癌是發(fā)生于喉黏膜上皮的惡性腫瘤，組織學(xué)上以鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)最常見，約占全部喉癌病例的95%～98%。喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過(guò)程中有許多致病因素在共同發(fā)揮作用，除了癌基因被激活外，一些因素引起的抑癌基因失活是另一個(gè)十分重要的因素[1]。Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(Ras association domain family 1A, RASSF1A)是由Damman等[2]在2000年對(duì)肺癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)的一種基因。目前認(rèn)為，RASSF1A基因抑制腫瘤的機(jī)制是該基因干預(yù)細(xì)胞周期的進(jìn)程，并可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。某些因素導(dǎo)致RASSF1A基因的啟動(dòng)子發(fā)生甲基化之后會(huì)進(jìn)一步引起RASSF1A基因失活并最終導(dǎo)致組織細(xì)胞周期紊亂而發(fā)生癌變[3，4]。

喉角化癥是喉部黏膜上皮生長(zhǎng)、成熟異常以及黏膜上皮過(guò)度角化的一種增生性病變，目前喉角化癥與成人喉乳頭狀瘤及慢性肥厚性喉炎均被認(rèn)為是喉的癌前病變[5]。本研究擬通過(guò)對(duì)正常喉粘膜、喉角化癥及喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RASSF1A的表達(dá)對(duì)比研究，初步探討RASSF1A基因在喉角化癥及喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的意義。

1 材料與方法

1.1喉組織標(biāo)本的采集及分組 收集自2009年12月到2012年12月安徽省立醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科確診并行手術(shù)中切除的喉鱗狀細(xì)胞癌、喉角化癥組織標(biāo)本共74例為實(shí)驗(yàn)組，其中男68例，女6例，年齡23～77歲，平均47歲；分為2組：①喉鱗狀細(xì)胞癌組織31例，其中男30例，女1例；高、中、低分化鱗癌分別為12、14及5例；I、II、III、IV期病例分別為9、5、11、6例；②喉角化癥組織43例，其中男38例，女5例。對(duì)照組為從冷凍新鮮尸頭標(biāo)本取的正常聲帶黏膜8例。

1.2免疫組化染色方法 各組標(biāo)本取材后以4%甲醛固定脫水后石蠟包埋制作切片，片厚4 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS洗3次各3分鐘；滴加3%H2O2，37 ℃靜置10分鐘，PBS洗3次各3分鐘；微波修復(fù)，高火5分鐘，冷卻后，重復(fù)一次；PBS洗3次各3分鐘，滴加正常山羊血清封閉液，室溫30分鐘；滴加I抗(1：200稀釋)50 μl/片，4 ℃過(guò)夜；過(guò)夜后室溫復(fù)溫20分鐘，PBS洗3次每次5分鐘，滴加II抗工作液50 μl/片，37 ℃ 30分鐘；PBS洗3次各5分鐘，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液50 μl/片，PBS洗3次各5分鐘；DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下觀察染色程度；自來(lái)水沖洗后蘇木精復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗10～15分鐘；脫水、透明、封片、烤片后進(jìn)行顯微鏡拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)正常喉黏膜組、喉角化癥組及喉鱗狀細(xì)胞癌組的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANNOVA)，兩組間比較用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RASSF1A在正常喉粘膜組織和喉角化癥組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1、2)，在喉鱗狀細(xì)胞癌中呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖3～5)，其在正常喉粘膜、喉角化癥及喉鱗狀細(xì)胞癌組中的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別為58.25%±8.89%、47.22%±2.35%及21.36%±10.98%；RASSF1A在喉鱗狀細(xì)胞癌的表達(dá)低于喉角化癥組織和正常喉組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；喉角化癥組織中RASSF1A表達(dá)陽(yáng)性率與正常喉粘膜組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 RASSF1A在正常喉黏膜中的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(+++) (免疫組化×400)圖2 RASSF1A 在喉角化癥中的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(+++) (免疫組化×400)圖3 RASSF1A在喉癌中的表達(dá)(高分化鱗癌) 呈弱陽(yáng)性(+) (免疫組化×400)圖4 RASSF1A在喉癌中的表達(dá)(中分化鱗癌) 呈弱陽(yáng)性(+) (免疫組化×400)圖5 RASSF1A在喉癌中的表達(dá)(低分化鱗癌) 呈弱陽(yáng)性(+) (免疫組化×400)

RASSF1A在I～I(xiàn)V期喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈逐漸下降趨勢(shì)，各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (表1)。而高分化、中分化及低分化鱗狀細(xì)胞癌組織中RASSF1A陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)(P>0.05)。

表1 I～I(xiàn)V期喉癌組織中的RASSF1A陽(yáng)性表達(dá)率比較(%)

表2 不同分化程度喉癌組織中的RASSF1A陽(yáng)情表達(dá)率(%)

3 討論

Ras相關(guān)區(qū)域家族1A(Ras association domain family1A,RASSF1A) 基因[6]定位于人類3p21.3染色體,由Damman等[2]在肺癌組織中分離得到。隨后在多種腫瘤如鼻咽癌、淋巴瘤等惡性腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)了RASSF1A基因的異常表達(dá)，并有國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了進(jìn)一步深入的研究[6，7]。在Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路中，RASSF1A蛋白是一種參與細(xì)胞周期調(diào)控的重要抑制蛋白，它通過(guò)多種途徑抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和衰老。其N端與富含半胱氨酸的甘油二酯結(jié)合區(qū)高度同源，也被稱作蛋白激酶C保守區(qū)1(C1)。如果將RASSF1A轉(zhuǎn)染入不表達(dá)該基因的癌細(xì)胞株，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞克隆的形成和非貼壁腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，接種于裸鼠后其成瘤生長(zhǎng)能力也明顯下降，由此確定了RASSF1A作為抑癌基因的作用[8]。

Jaroslaw等[9]對(duì)41例喉鱗狀細(xì)胞癌組織進(jìn)行相關(guān)研究后認(rèn)為，RASSF1A可以阻斷Ras-RASSF1-ERK通路的信號(hào)傳導(dǎo),使Ras生長(zhǎng)效應(yīng)信號(hào)不能夠從細(xì)胞外轉(zhuǎn)向細(xì)胞內(nèi),從而喪失促進(jìn)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞分化和激活原癌基因的功能,通過(guò)這種機(jī)制來(lái)發(fā)揮抑制細(xì)胞癌變的作用。許承弼等[10]報(bào)道喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RASSF1A蛋白的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于癌旁組織和正常喉組織，提示喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生與RASSFlA蛋白表達(dá)降低有關(guān)，并且認(rèn)為RASSFlA的表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床分期有關(guān)，不同臨床分期喉鱗狀細(xì)胞癌組織RASSFlA蛋白的表達(dá)程度不同，臨床分期越晚，RASSFlA蛋白表達(dá)水平越低，提示RASSFlA的表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。從本研究結(jié)果看，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RASSF1A蛋白的表達(dá)低于正常喉組織，且I～I(xiàn)V期喉癌組織中其表達(dá)強(qiáng)度也逐漸降低，與上述文獻(xiàn)相符，表明RASSFlA蛋白表達(dá)降低與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程有關(guān)。 在本組所有喉鱗狀細(xì)胞癌組織中，高分化、中分化及低分化癌組織中RASSF1A表達(dá)水平無(wú)明顯差異，表明喉鱗癌的細(xì)胞分化水平與RASSF1A基因表達(dá)水平無(wú)關(guān)，說(shuō)明RASSF1A基因作為一種抑癌基因，發(fā)生缺失或突變后可導(dǎo)致細(xì)胞癌變，但并不能決定癌細(xì)胞的分化程度。

郭偉等[11]在對(duì)喉癌及癌前病變中細(xì)胞周期調(diào)控基因甲基化的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期調(diào)控基因p14、p15及p16基因啟動(dòng)子及甲基化在正常喉組織、喉角化癥及喉鱗狀細(xì)胞癌組織中基因啟動(dòng)子過(guò)甲基化及蛋白表達(dá)水平呈逐漸變化的趨勢(shì)，說(shuō)明在喉黏膜組織由正常向癌前病變進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤過(guò)程中，與相關(guān)基因的異常表達(dá)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，在喉角化癥組織中，RASSF1A蛋白表達(dá)低于正常喉黏膜組織，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不能認(rèn)為抑癌基因RASSF1A基因的表達(dá)降低與喉角化癥的發(fā)生有關(guān)；但是，RASSF1A基因在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于喉角化癥組織，至少提示RASSF1A基因可能參與了喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的早期過(guò)程，可將其作為喉鱗狀細(xì)胞癌的早期預(yù)警指標(biāo)，在鑒別某一喉部病變是否已由癌前病變惡變?yōu)楹戆r(shí)可能有一定意義。

綜上所述， RASSFlA蛋白在喉癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于正常喉組織，且臨床分期越晚，表達(dá)強(qiáng)度越低，提示該蛋白表達(dá)降低與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展可能有關(guān)；對(duì)RASSFlA蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，有助于篩查RASSFlA基因異常的人群，提高喉鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷水平，并對(duì)鑒別癌前病變與喉癌有一定意義。

4 參考文獻(xiàn)

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