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    灌木柳無性系莖段組織培養(yǎng)快速繁殖試驗

    2014-06-09 14:20:32陳智敏王保松黃利斌施士爭
    江蘇林業(yè)科技 2014年5期
    關鍵詞:莖段外植體灌木

    陳智敏,張 敏,王保松,黃利斌,施士爭,張 玨

    (1.河南省水利勘測設計研究有限公司,河南 鄭州 450000;2.江蘇省林業(yè)科學研究院,江蘇 南京 211153)

    灌木柳無性系莖段組織培養(yǎng)快速繁殖試驗

    陳智敏1,張 敏2*,王保松2,黃利斌2,施士爭2,張 玨2

    (1.河南省水利勘測設計研究有限公司,河南 鄭州 450000;2.江蘇省林業(yè)科學研究院,江蘇 南京 211153)

    以灌木柳無性系2345、2367的嫩枝為外植體,進行組織培養(yǎng)快速繁殖技術的研究。結果表明:2種灌木柳芽苗誘導最適培養(yǎng)基為WPM+6-BA 0.4 mg/L+GA30.1 mg/L+CH 500 mg/L+活性炭1 g/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠6.3 g/L;最適增殖及生根培養(yǎng)基為WPM+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.05 mg/L+CH 500 mg/L+活性炭1 g/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠6.3 g/L。將健壯生根苗移栽到含有泥炭和黃心土的基質(zhì)中,其中泥炭與黃心土的體積比為1∶1,成活率大于98%。

    灌木柳;組織培養(yǎng);莖段

    柳樹是楊柳科(Salicaceae)柳屬(Salix)植物的通稱,全世界共有526種,主要分布在北半球溫帶地區(qū)。中國有257種,120個變種和33個變型,其中絕大多數(shù)為灌木柳。灌木柳分布廣、生長快、產(chǎn)量高、熱值高、抗逆性強、易于更新以及木材用途廣泛,是防護林、水土保持林、風景林及用材林的重要組成樹種,也是備受關注的能源樹種[1-2]。柳樹種間及其雜交子代的家系、無性系間都存在著非常豐富的遺傳變異,因此進行速生、高生物量、耐鹽堿、抗病蟲害良種選育具有豐富的遺傳基礎[3]。

    灌木柳的常規(guī)繁殖以扦插為主,不同種柳樹插條生根能力除了由遺傳因素決定以外,還受到插條年齡、粗度、木質(zhì)化程度、有無生長葉或活動芽等指標的影響,特別是繁殖時間有嚴格的季節(jié)限制。灌木柳還可用播種育苗進行繁殖,但其種子較小,宜隨采隨播,且不能保持良種原有的優(yōu)良特性。組織培養(yǎng)技術是目前林業(yè)生物技術的主要內(nèi)容之一,其主要用途是林木的大規(guī)模繁殖和分子育種[4]。灌木柳高效組織培養(yǎng)再生體系的成功建立,對其生物學研究、遺傳改良和多目標分子育種等工作的開展均具有重要意義。

    本試驗以2種灌木柳無性系的莖段為初始外植體,通過分析其離體再生的影響因素,探討最佳組織培養(yǎng)條件,建立高效離體再生體系,為柳樹遺傳轉化研究和分子育種的離體誘導奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    本試驗所用材料為江蘇省林業(yè)科學研究院遺傳育種研究所雜交培育的2個高生物量灌木柳無性系2345、2367,其來源見表1。

    表1 2種灌木柳無性系及其來源

    取生長健壯、無病蟲害的1~2年生柳樹枝條,摘除老葉,置于室溫下水培7 d,每天換水1次,以新長出的嫩莖作為外植體。

    1.2 方法

    1.2.1 材料處理 將新生嫩莖去葉,剪成長4 cm的小段,用洗衣粉水浸泡20 min,自來水沖洗5次,備用。

    1.2.2 接種 將沖洗干凈的外植體轉到超凈工作臺上,用70%(體積百分數(shù))乙醇和0.1%(質(zhì)量百分數(shù))HgCl2作為消毒劑,酒精處理時間相同都為40 s,升汞的處理時間分別為2.5,3,4,5 min及6 min,再用無菌水沖洗5~7次。

    將消毒處理后的外植體剪去接觸消毒液的傷口部位,留1~2 cm帶芽莖段接種在含有誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。每處理接種20瓶,每瓶5個外植體。14 d后觀察其污染及成活情況,并統(tǒng)計污染率。

    1.2.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 誘導培養(yǎng)基:以WPM為基本培養(yǎng)基,其中均添加CH 500 mg/L,活性炭1 g/L,蔗糖30 g/L和卡拉膠6.3 g/L,在GA3質(zhì)量濃度相同的情況下,添加不同質(zhì)量濃度的6-BA,在6-BA質(zhì)量濃度相同的情況下添加不同質(zhì)量濃度的GA3,探索適合灌木柳叢芽誘導的激素質(zhì)量濃度篩選出合適的培養(yǎng)基配方。

    選取相同條件下生長良好的水培得到的嫩莖作為外植體,用篩選出的適宜消毒時間進行消毒,消毒后將其切成長1~2 cm的莖段接種到添加不同質(zhì)量濃度激素的WPM培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基中激素配比見表3),將其置于光照度為1 500~2 000 lx,每日光照時間為16 h,溫度(26±2)℃,相對濕度65%~75%的條件培養(yǎng);重復3次。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計萌芽率。

    增殖培養(yǎng)基:將誘導產(chǎn)生的試管苗,剪切成1.5~2.0 cm帶有1~2個腋芽的節(jié)段,轉接于以WPM為基本培養(yǎng)基,添加不同質(zhì)量濃度激素的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)(培養(yǎng)基中激素配比見表4)。培養(yǎng)環(huán)境同初代培養(yǎng),培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

    1.2.4 煉苗 將增殖培養(yǎng)獲得的健壯再生植株開瓶培養(yǎng)2 d進行煉苗,取出試管苗,洗凈,移栽到含有泥炭和黃心土的基質(zhì)中進行煉苗,其中泥炭與黃心土的體積比為1∶1。

    1.2.5 結果評測指標 材料接種后,定期觀察記錄生長情況,主要統(tǒng)計指標及計算公式如下[5]:

    死亡率/%=死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100;

    污染率/%=污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100;

    誘導率/%=萌發(fā)出葉片的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100;

    增殖系數(shù)/%=增殖后的芽苗數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100;

    生根率/%=生根的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100;

    移栽成活率%=移栽成活的植株數(shù)/移栽的植株總數(shù)×100。

    2 結果與分析

    2.1 不同消毒處理對誘導培養(yǎng)的影響

    由結果(見表2)可知,不同滅菌處理對2種灌木柳無性系的死亡率和污染率影響不盡相同。使用質(zhì)量分數(shù)為0.1%的HgCl2消毒5 min,2個品種的成活率均最高,分別為98%和99%,滅菌效果明顯。隨著HgCl2消毒時間的延長,污染率均降低,但對外植體造成了傷害,致使死亡率升高。綜合分析死亡率、污染率的測定結果,2種試驗材料均以體積分數(shù)為75%的乙醇40 s結合質(zhì)量分數(shù)為0.1%的HgCl2處理5 min為最佳消毒方案。

    表2 不同方式的滅菌效果

    2.2 不同激素質(zhì)量濃度配比對誘導培養(yǎng)的影響

    灌木柳2345及2367均在接種后7 d即開始萌芽,從結果(見表3)可以看出,2個品種在各個培養(yǎng)基間的差異均極顯著,在GA3質(zhì)量濃度相同的情況下,誘導率隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加均呈現(xiàn)先高后低的趨勢,在6-BA質(zhì)量濃度為0.4 mg/L時,誘導率達96%和95%。在6-BA質(zhì)量濃度相同的情況下,誘導率隨著GA3質(zhì)量濃度的增加而增加,且在各個培養(yǎng)基中均有根產(chǎn)生。

    2.3 繼代與增殖培養(yǎng)

    組織培養(yǎng)苗的增殖指在無性條件下芽的生長與分化,最后繁殖成完整植株[6-7]。本研究中,2個品種在不同激素組合間的差異均極顯著。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對莖芽增殖的影響見表4,在GA3質(zhì)量濃度相同時,隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加,增殖系數(shù)呈現(xiàn)先降后增的趨勢。在6-BA質(zhì)量濃度相同時,隨著NAA質(zhì)量濃度的增大增殖系數(shù)逐漸降低。在各個培養(yǎng)基中均有大量根系產(chǎn)生,其中在培養(yǎng)基WPM+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.05 mg/L+CH 500 mg/L+活性炭1 g/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠中6.3 g/L的增殖系數(shù)可達4~6倍,生根率高達100%。

    表3不同激素組合對灌木柳帶芽莖段萌發(fā)的影響

    2.4 馴化移栽

    將試管苗株高6~8 cm、根系發(fā)達,根長且葉片展開的再生植株開瓶培養(yǎng)2 d進行煉苗,取出試管苗,洗凈,移栽到含有泥炭和黃心土的基質(zhì)中,其中泥炭與黃心土的體積比為1∶1,然后澆透水,用塑料薄膜覆蓋容器口,保持溫度24~28℃,相對濕度75%~85%,適當遮蔭,培養(yǎng)15~20 d至長出的新葉完全展開后,去掉覆蓋的塑料薄膜,獲得灌木柳苗木,成活率98%以上(見圖1)。

    3 結論與討論

    酒精對細胞具有較強的穿透性和殺傷性,容易使被處理的材料受到損傷,因此把握好消毒時間是保持材料活性的關鍵。以灌木柳莖段為外植體進行組織培養(yǎng)時,適宜的消毒條件為以70%(體積分數(shù))乙醇40 s+0.1%(質(zhì)量百分數(shù))升汞5 min。

    表4不同激素組合對灌木柳帶芽莖段增殖的影響

    圖1 灌木柳離體培養(yǎng)與植株再生

    2種灌木柳芽苗誘導最適培養(yǎng)基為WPM基本培養(yǎng)基+6-BA 0.4 mg/L+GA30.1 mg/L+CH 500 mg/L+活性炭1 g/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠6.3 g/L。在選擇莖段培養(yǎng)基時,激素搭配應以外植體不愈傷化為基本原則,使其直接發(fā)育長成植株。因為若經(jīng)過愈傷組織分化,植株容易發(fā)生變異,所以倡導以不含生長素的培養(yǎng)基進行莖尖分生組織的誘導[8]。

    本研究中最適增殖培養(yǎng)基為WPM基本培養(yǎng)基+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.05 mg/L+CH 500 mg/L+活性炭1 g/L+蔗糖30 g/L+卡拉膠6.3 g/L。在該培養(yǎng)基中同時可獲得健壯的生根苗,無需專門的壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段?;钚蕴靠纱龠M組織培養(yǎng)苗健壯生長,有利于根的生成[9]。組織培養(yǎng)苗根系有避光生長的特性,活性炭可提供暗環(huán)境,為培養(yǎng)基中光敏性生長素的積累提供合適的環(huán)境[10~11]。由于根頂端能產(chǎn)生利于根生長的IAA,但IAA易受光氧化而被破壞,因此活性炭的作用正是通過減弱光照保護了IAA,從而間接地促進了根的生長。本研究也發(fā)現(xiàn)如果不加活性炭植株會變?nèi)?,且根系減少。

    近些年,生物技術的不斷發(fā)展與應用為柳樹遺傳育種開創(chuàng)了新的途徑。柳樹組織培養(yǎng)的難易與基因型、培養(yǎng)基的類型和光照溫度等培養(yǎng)條件密切相關[12]。如何繼續(xù)提高芽的增殖系數(shù)和試管苗的成苗速度,建立高效的遺傳轉化體系,還有待于進一步研究。

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    S792.12;Q943.1

    A

    10.3969/j.issn.1001-7380.2014.05.007

    1001-7380(2014)05-0027-03

    2014-07-07

    國家自然科學基金“NaCl脅迫下一氧化氮調(diào)控灌木柳液泡膜H+-ATPase的分子機制”(31300515);江蘇省自然科學基金“柳樹H+-ATPase響應NaCl脅迫的分子機制”(BK2011872)

    陳智敏(1987-),女,河南商丘人,碩士,主要從事水環(huán)境植物配置研究與設計。

    *通信作者:張 敏(1980-),女,內(nèi)蒙古人,副研究員,博士,主要從事植物逆境生物學及林木花卉良種繁育研究。

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