γ-干擾素釋放試驗(yàn)對結(jié)核病患者臨床診斷性能評價(jià)研究

秦建成，徐軍，戴亮，趙靜，王衛(wèi)東，李想，張嵐，毛遠(yuǎn)麗

γ-干擾素釋放試驗(yàn)對結(jié)核病患者臨床診斷性能評價(jià)研究

秦建成，徐軍，戴亮，趙靜，王衛(wèi)東，李想，張嵐，毛遠(yuǎn)麗

目的評價(jià)采用A.TB試劑［酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）］進(jìn)行結(jié)核桿菌特異性γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-gamma release assays,IGRAs）對結(jié)核病的臨床診斷性能及應(yīng)用價(jià)值。方法108例研究對象中，臨床明確診斷結(jié)核病60例（結(jié)核組），非結(jié)核病對照者48例（非結(jié)核對照組）。同時(shí)采用A.TB試劑（ELISA法）和T-SPOT. TB試劑［酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbentspot,ELISPOT）］進(jìn)行IGRAs。結(jié)果A.TB試劑（ELISA法）檢測的靈敏度為86.67%，特異度為85.42%，受試者工作特征曲線（receiver-operating characteristic curve,ROC曲線）下面積為0.822，95%可信區(qū)間（confidence interval,CI）為0.733～0.912。T-SPOT.TB試劑（ELSPOT法）檢測靈敏度為91.67%，特異度為87.50%，ROC曲線下面積為0.884，95%CI為0.806～0.962。ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.081，P=0.776）。2種檢測方法一致率為87.04%（94/108），Kappa值為0.738。結(jié)論A.TB試劑和T-SPOT.TB試劑檢測的整體診斷性能相似，且A.TB試劑檢測在操作和檢測結(jié)果判讀方面明顯優(yōu)于T-SPOT.TB試劑。

干擾素γ釋放試驗(yàn)；結(jié)核分枝桿菌；預(yù)測；免疫印跡法；指示劑和試劑

結(jié)核病不僅是嚴(yán)重危害公眾健康的全球性公共衛(wèi)生問題，更是社會經(jīng)濟(jì)和居民健康水平等社會宏觀因素的一種外在表現(xiàn)[1-2]。我國是全球第二大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核病發(fā)病人數(shù)始終位居法定報(bào)告甲、乙類傳染病前列[3]。因此結(jié)核病的防控十分重要，但傳統(tǒng)的方法難以滿足臨床檢測的需求。近年來結(jié)核分枝桿菌基因組學(xué)的研究成果——γ-干擾素釋放試驗(yàn)（interferon-gamma release assays,IGRAs）在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用與研究越來越受到國內(nèi)外專家學(xué)者的重視[4]。其中，T-SPOT. TB試劑［酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent spot,ELISPOT）］作為IGRAs的試劑于2001年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，美國疾病預(yù)防控制中心推薦T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測為替代結(jié)核菌素試驗(yàn)更有效的方法，并為其制訂了使用指南[5-6]。我國臨床實(shí)驗(yàn)室及科研機(jī)構(gòu)近幾年也進(jìn)行了基于IGRAs原理的結(jié)核檢測產(chǎn)品研制與應(yīng)用。本研究對基于同一IGRAs原理的國產(chǎn)A.TB試劑［酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked im-munosorbent assay,ELISA）］進(jìn)行臨床診斷性能評估，并與T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）對結(jié)核病患者的臨床診斷性能進(jìn)行比較。

1 對象與方法

1.1 對象共納入108例研究對象。臨床明確診斷結(jié)核病60例（結(jié)核組），其中菌陽肺結(jié)核21例，菌陰肺結(jié)核39例；男36例，女24例，年齡（43.1±5.4）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：菌陽肺結(jié)核為痰抗酸桿菌涂片連續(xù)2次（+），或1次（++），或1次結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）培養(yǎng)陽性；菌陰肺結(jié)核為痰抗酸桿菌涂片3次陰性以及Mtb培養(yǎng)1次陰性，有典型的肺結(jié)核臨床癥狀和X線胸片表現(xiàn)，抗結(jié)核治療有效，臨床可排除其他非結(jié)核性肺部疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：急性病毒感染、妊娠和長期大量應(yīng)用免疫抑制劑者。非結(jié)核病對照者48例（非結(jié)核對照組），其中男27例，女21例，年齡（42.6±12.4）歲。非結(jié)核對照組均經(jīng)病理或臨床檢查確診，既往無結(jié)核病史和接觸史，結(jié)核菌素試驗(yàn)均為陰性，為Mtb感染低暴露風(fēng)險(xiǎn)的慢性乙型肝炎患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑A.TB試劑盒系?？诰S瑅璦生物研究院產(chǎn)品；T-SPOT.TB試劑盒系英國Oxford Immunotec公司產(chǎn)品；AIM-V培養(yǎng)液和PRMI 1640培養(yǎng)液系美國Gibcobrl公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液系CEDARLANE公司產(chǎn)品。

1.2.2 儀器儀器包括美國伯樂Bio-rad酶標(biāo)儀、Sanyo CO2培養(yǎng)箱（CO2Incubator）、Thermo MSC-1.2 1PE AC超凈工作臺、contess細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和C.T.L. S6UV酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀。

1.3 檢測方法

1.3.1 A.TB試劑（ELISA法）檢測采集3ml外周血標(biāo)本置于肝素鋰抗凝試管中，立即混勻，16 h內(nèi)將新鮮全血分別加入到含有陰性刺激劑（N）、陽性刺激劑（P）和特異性抗原刺激劑（T）的3支試管中，每管1ml，混勻，37℃孵育22～24 h后收集血漿，ELISA法檢測血漿中干擾素γ的含量，孵育后血漿可于2～8℃保存，2周內(nèi)檢測，或-20℃以下長期保存。結(jié)果判讀：參照A.TB試劑盒說明書，當(dāng)N＜500 IU/L時(shí)，（T-N）/（P-N）≥0.6；或N≥500 IU/L時(shí)，（T-N）/（P-N）≥0.85，均判定為陽性，否則為陰性。

1.3.2 T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測采集6 ml外周血，4 h內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分離；將細(xì)胞多次洗滌后計(jì)數(shù)，并將標(biāo)本濃度調(diào)整至250萬/m l。按TSPOT.TB試劑盒說明書將細(xì)胞懸液加入專用微孔板。37℃5%CO2孵育箱中孵育16～20 h，磷酸鹽緩沖液洗板，加抗體，于2～8℃冰箱孵育1 h，洗板，顯色7min，蒸餾水沖洗后觀察結(jié)果。用酶聯(lián)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)儀觀察并計(jì)數(shù)每個(gè)孔中的斑點(diǎn)。結(jié)果判讀：陰性斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，抗原A和抗原B檢測孔計(jì)數(shù)-陰性孔計(jì)數(shù)≥6判定為陽性；如果陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算2種方法的靈敏度和特異度。A.TB與T-SPOT.TB試劑檢測診斷效能采用一致性檢驗(yàn)。分別繪制2種試劑檢測的受試者工作特征曲線（receiver-operating characteristic curve,ROC曲線），比較曲線下面積。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 診斷試驗(yàn)結(jié)果A.TB試劑（ELISA法）檢測靈敏度為86.67%，特異度為85.42%；T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測靈敏度為91.67%，特異度為87.50%。見表1～2。

表1 A.TB試劑(ELISA法)診斷試驗(yàn)結(jié)果(例)Table 1 Diagnostic results of ELISA-based IGRAs w ith A.TB kit(cases)

表2 T-SPOT.TB試劑(ELISPOT法)診斷試驗(yàn)結(jié)果(例)Table 2 Diagnostic results of ELISPOT-based IGRAs w ith T-SPOT.TB kit(cases)

2.2 一致性檢驗(yàn)結(jié)果比較A.TB試劑（ELISA法）和T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測的診斷結(jié)果，檢測均為陽性的53例，均為陰性的41例，一致率為87.04%（94/108），Kappa=0.738，提示2種試劑檢測具有較高的一致性。見表3。

表3 A.TB試劑(ELISA法)和T-SPOT.TB試劑(ELISPOT法)檢測的一致性檢驗(yàn)(例)Table 3 Consistency between ELISA-based IGRAs w ith A.TB kit and ELISPOT-based IGRAs w ith T-SPOT.TB kit(cases)

2.3 ROC曲線分析以病原學(xué)檢測為金標(biāo)準(zhǔn)，做A.TB試劑（ELISA法）和T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）診斷108例患者的ROC曲線。用雙正態(tài)參數(shù)法計(jì)算曲線下面積。A.TB試劑（ELISA法）檢測的ROC曲線下面積為0.822，95%可信區(qū)間（confidence interval,CI）為0.733～0.912；T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測的ROC曲線下面積為0.884，95%CI為0.806～0.962（圖1）。2個(gè)ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.081，P=0.776）。取曲線斜率45度切點(diǎn)位置為診斷閾值，A.TB試劑（ELISA法）的診斷閾值為0.6（比值），對應(yīng)的靈敏度為86.67%，特異度為85.42%；T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）得診斷閥為6（斑點(diǎn)數(shù)），對應(yīng)的靈敏度為91.67%，特異度為87.50%。

圖1 A.TB試劑(ELISA法)和T-SPOT.TB試劑(ELISPOT法)診斷結(jié)核病的ROC曲線Figure 1 ROC curves of ELISA-based IGRAsw ith A.TB kit and ELISPOT-based IGRAsw ith T-SPOT.TB kit

3 討論

IGRAs是近年來發(fā)展起來的用于檢測Mtb感染的新方法，國外資料報(bào)道其檢測潛伏性Mtb感染的靈敏度達(dá)70%～80%，特異度達(dá)88%～97%[6]。我國Mtb感染率高，流行病學(xué)背景不同于歐美國家，IGRAs主要應(yīng)用于結(jié)核病的診斷和鑒別。Mtb感染與結(jié)核病也有著較大差別，IGRAs并不能明確區(qū)分活動性結(jié)核病和潛伏性Mtb感染。本研究旨在探討A.TB試劑（ELISA法）對結(jié)核病患者的臨床診斷性能及應(yīng)用價(jià)值。

根據(jù)IGRAs原理發(fā)展來的檢測方法有基于全血培養(yǎng)的ELISA法，如QuantiFERON-TB、Gold In-Tube、QFT-GIT等檢測方法和基于PBMCs培養(yǎng)的ELISPOT法，如T-SPOT.TB檢測方法。目前已有大量國內(nèi)外研究表明，IGRAs的2種方法（ELISA法和ELISPOT法）的診斷性能相似[7-9]，這與本研究結(jié)果相符。

雖然A.TB試劑（ELISA法）檢測與T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測都是基于IGRAs原理的結(jié)核檢測方法，但它們在檢測技術(shù)、試驗(yàn)操作以及在臨床檢驗(yàn)科室使用的便捷性等方面有著顯著區(qū)別。A.TB試劑（ELISA法）檢測是通過ELISA法檢測全血中的干擾素γ水平，而T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）是通過ELISPOT法檢測PBMCs中釋放干擾素γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量。在樣本采集和處理過程中，A.TB試劑（ELISA法）檢測要求采集3ml肝素抗凝靜脈全血，室溫保存，可16 h內(nèi)使用，從樣品處理到檢測只需要全血分裝和37℃培養(yǎng)2步，操作簡單，不需要專業(yè)培訓(xùn)。檢測過程使用ELISA法，通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算患者特異性T細(xì)胞因特異性抗原刺激后干擾素γ分泌的水平。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出N、P和T 3個(gè)培養(yǎng)管中干擾素γ的含量，以此來判斷結(jié)果。因?yàn)槿囵B(yǎng)檢測模擬人體內(nèi)自然的免疫反應(yīng)過程，不改變T細(xì)胞的數(shù)目和存在環(huán)境，結(jié)果更真實(shí)。T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測要求采集6ml肝素抗凝靜脈全血，室溫保存，僅4 h內(nèi)使用。處理過程需要PBMCs分離、多次洗滌、T細(xì)胞稀釋計(jì)數(shù)、二氧化碳培養(yǎng)等步驟。操作要求高，需要專門細(xì)胞間進(jìn)行細(xì)胞操作。對操作人員的操作要求高，需要進(jìn)行專門的培訓(xùn)。該檢測以計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)目來判斷檢測結(jié)果，細(xì)胞計(jì)數(shù)可使用顯微鏡和放大鏡進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，工作量大，受主觀因素影響多；使用酶聯(lián)斑點(diǎn)圖像分析儀，其計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，但價(jià)格昂貴。T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測在試驗(yàn)操作、試驗(yàn)條件、人員技術(shù)以及儀器設(shè)備等方面均要求較高，在臨床檢驗(yàn)科室使用的便捷性等方面受到限制，不太適合社區(qū)等的小型醫(yī)院使用。實(shí)際操作中T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測結(jié)果判讀常見斑點(diǎn)模糊不易計(jì)數(shù)，陰、陽性對照孔斑點(diǎn)容易污染，甚至出現(xiàn)不確定結(jié)果等現(xiàn)象。而A.TB試劑（ELISA法）檢測結(jié)果判讀為綜合考慮全血細(xì)胞的本底對照、特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)、非特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)等因素的影響，避免了不確定結(jié)果的出現(xiàn)。

雖然A.TB試劑（ELISA法）檢測和T-SPOT.TB試劑（ELISPOT法）檢測是目前檢測結(jié)核病的較為準(zhǔn)確、先進(jìn)的2種方法，但它們在試驗(yàn)技術(shù)與臨床應(yīng)用等方面還存在一些問題，如試驗(yàn)結(jié)果的影響因素不是十分明確,試驗(yàn)條件有待進(jìn)一步優(yōu)化,在結(jié)核病伴嚴(yán)重免疫系統(tǒng)疾病中的研究不足等。相信通過不斷的探索、研究與改進(jìn)，定會使A.TB試劑（ELISA法）檢測在結(jié)核病檢測中發(fā)揮其更大的作用。

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（2014-08-12收稿2014-09-11修回）

（責(zé)任編委王永怡本文編輯王姝）

Evaluation of clinical diagnostic performance of interferon-gamma release assays for tuberculosis

QIN Jian-cheng,XU Jun,DAILiang,ZHAO Jing,WANGWei-dong,LIXiang,ZHANG Lan,MAO Yuan-li*
Clinical Laboratory Center,302 Hospital of PLA,Beijing 100039,China
*Corresponding author,E-mail:maoyuanlee@163.com

Objective To evaluate the diagnostic performance and application value of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based interferon-gamma release assays(IGRAs)with A.TB kit for patientswith tuberculosis.M ethods Of 108 patients enrolled in the study,60 were definitely diagnosed with tuberculosis(tuberculosis group),and 48 were controls(non-tuberculosis group). ELISA-based IGRAs with A.TB kit and enzyme-linked immunosorbent spot(ELISPOT)-based IGRAswith T-SPOT.TB kitwere carried out simultaneously.Results The sensitivity and specificity of ELISA-based IGRAs with A.TB kit were 86.67%and 85.42%, and the area under a receiver-operating characteristic(ROC)curve was 0.822[95%confidence interval(CI),0.733-0.912].The sensitivity and specificity of ELISPOT-based IGRAs with T-SPOT.TB kitwere 91.67%and 87.50%,and the area under ROC curve was0.884(95%CI,0.806-0.962).The difference in the area under ROC curvewas notsignificantbetween the two assays(χ2=0.081,P= 0.776).The consistency of the two assays was 87.04%(94/108)with the Kappa value of 0.738.Conclusions ELISA-based IGRAs with A.TB kit and ELISPOT-based IGRAs with T-SPOT.TB kit have a similar overall diagnostic performance,but ELISA-based IGRAswith A.TB kit is superior to ELISPOT-based IGRAswith T-SPOT.TB kit in the operation and interpretation of the test results.

interferon-gamma release tests;Mycobacterium tuberculosis;forecasting;immunoblotting;indicators and reagents

R392.114；R378.911

A

1007-8134(2014)05-0302-04

國家“十二五”科技重大專項(xiàng)（2013ZX09J13106-06A）

100039北京，解放軍第三○二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心（秦建成、徐軍、戴亮、趙靜、王衛(wèi)東、李想、張嵐、毛遠(yuǎn)麗）

毛遠(yuǎn)麗，E-mail:maoyuanlee@163.com